随着生物信息学的不断发展，吸引读者的注意变得越来越具有挑战性。然而，无论采用何种新颖的方法或技术，经典的生物信息学分析方法仍然至关重要，是基础，是基石。研究方法应基于可靠的理论和实验设计，采用合适的数据分析和统计方法，才能确保得出准确、可靠的结论。今天，大家跟随小记者一起来阅读这一篇用经典分析方法来研究疾病发病机制的文章。Ps：非常地适合小白学习哦~
本文研究的疾病是慢性关节疾病中的骨关节炎，骨关节炎是很复杂的疾病，发病机制一直未解决，所以作者想法就来了，利用生物信息学分析方法进行初步探索。作者首先从GEO数据库中检索OA相关基因表达谱数据，然后使用xCell算法、GEO2R、SangerBox网站的富集分析、CytoHubba、ROC逻辑回归和相关分析对一系列数据进行了分析，最后获得了目标细胞和基因。（PS：没有思路、不知道怎么创新的宝子们，记得来找小记者哦，超多个性化思路等你来拿！）
题目：基于生物信息学分析的骨关节炎有效生物标志物及浸润性免疫细胞的探索
杂志：Artif Cells Nanomed Biotechnol
影响因子：IF=5.8
发表时间：2023年5月在线发表
研究背景
骨关节炎（OA）是一种病因不明的慢性退行性关节疾病。在全球范围内，OA是慢性关节疾病中最常见的，发病率随着年龄的增长而逐渐增加。截至2017年，OA影响了3.03亿人，对人类健康构成重大威胁，并造成了巨大的经济负担。尽管如此，OA的发病机制仍然是一个悬而未决的问题。为了制定更好的OA预防和治疗策略，有必要阐明这种疾病发生和发展的潜在机制。
数据库
数据集/队列 |
数据库 |
数据类型 |
详细信息 |
GSE169077 |
GEO |
Seq-RNA |
11个样本，6个OA样本,5个正常组织样本 |
GSE55235 |
GEO |
Seq-RNA |
20个样本，10个OA样本,10个正常组织样本 |
GSE55457 |
GEO |
Seq-RNA |
20个样本，10个OA样本,10个正常组织样本 |
研究思路
首先，从GEO数据库中检索与OA相关的基因表达谱数据。然后，运用Xcell算法、GEO2R、SangerBox网站富集度分析、CytoHubba、ROC Logistic回归和相关分析等方法对一系列数据进行了分析。最终得到9个不同丰度的免疫细胞在骨性关节炎和正常组织中的分布。骨性关节炎有42个IODEGs，它们的功能与免疫细胞和相应的生物学过程有关。此外，还鉴定了5个HUB基因，包括GREM1、Nrp1、VEGFA、FYN和IL6R。相关分析显示，Nrp1与NKT细胞呈负相关，Nrp1、GREM1与ADC呈正相关，VEGFA与CD8幼稚T细胞呈正相关，VEGFA、FYN、IL6R与巨噬细胞M1呈负相关。
研究结果
1、OA和正常样本之间的免疫细胞浸润
首先根据GEO数据分析OA和正常组织中的免疫细胞浸润。PCA分析表明，两种样本类型之间的免疫细胞浸润差异具有统计学意义（图1A）。64个免疫细胞群体的特异性浸润通过xCell算法进行分析，并可视化为热图（图1B）和盒图（图1C）。正如分析的那样，OA和正常组织之间差异最显著的浸润性免疫细胞主要是aDC、星形胶质细胞、CD8+幼稚T细胞、CMP、巨噬细胞、巨噬细胞M1、中性粒细胞、NKT和Th1细胞。计算九个免疫细胞群的相应比例（图1D）。相关分析表明，星形胶质细胞与CMP呈正相关（r = 0.87），而NKT与中性粒细胞呈最强的负相关（r = −0.77）（图1E）。与正常组织相比，OA组织具有显著丰富的aDC、星形胶质细胞、CMP、巨噬细胞、巨噬细胞M1和中性粒细胞（图2A–F），但CD8+幼稚T细胞、NKT和Th1细胞含量较低（图2G–I）。
图1、OA和正常组织中的免疫细胞浸润
图2、OA中浸润性免疫细胞的上调和下调
2、介于OA和正常组织之间lodegs
在GSE169077数据集中，OA与正常组织之间共筛选出382个DEGs，其中OA样本(图3A、B)中上调基因166个，下调基因216个。同时，从ImmPort数据库中检索到1793个免疫相关基因。将382个DEGs与1，793个免疫相关基因(图3C、D)取交集得到IODEGs。结果共获得42个IODEGs，包括23个上调基因和19个下调基因(表2)。
图3、OA相关DEG和IODEGs
表1、OA组和正常组之间的IODEGs
3、对IODEGs进行GO和KEGG通路分析
IODEGs的GO条目以BP、CC、MF表示。相对于BP，IODEGs主要富集在免疫细胞相关通路，包括细胞表面受体信号通路、免疫系统过程调节、细胞粘附调节、免疫系统过程正调控(图4A和B)等；对于CC，IODEGs富集在MHC蛋白复合物、胞外区和细胞外基质(图4C和D)；而对于MF，IODEGs主要富集在信号受体结合、受体配体活性、受体调节因子活性、T细胞受体结合和G蛋白偶联谷氨酸受体结合(图5A和B)。IODEGs富集的KEGG通路主要涉及Th17细胞分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TGF-beta信号通路、PI3K-Akt信号通路、抗原处理和呈递、类风湿性关节炎、T细胞受体信号通路、ANDJak-STAT信号通路(图5C和D)。总之，IODEGs的功能与免疫细胞密切相关。
图4、从BP和CC角度看IODEGs的GO分析
图5、从MF和KEGG途径看IODEGs的GO分析
4、Hub基因的鉴定与可视化
通过STRING数据库生成IODEGs的PPI网络，并通过Cytoscape (图6A、B)进行可视化。利用Cytoscape的插件CytoHubba实现的8种算法，对排名前15位的节点(基因)进行打分并可视化(图7A ~ H)。利用R包' UpSet '进一步筛选得到8个Hub基因，包括在OA中表达下调的VEGFA、FYN和IL6R，以及表达上调的NGF、PTN、FGF1、NRP1和GREM1。它们在GSE169077微阵列数据集中的表达被可视化为Heatmap (图8A、B)。在GSE55235和GSE55457数据集中验证了8个Hub基因的表达，并将其可视化为箱线图和Heatmap (图8C、D)。与之一致的是，VEGFA、FYN和IL6R在OA组织中的表达显著低于正常组织，而NRP1和GREM1在OA组织中的表达显著高于正常组织。由此推断，VEGFA、FYN、IL6R、NRP1和GREM1可作为诊断OA的候选生物标志物。
图6、PPI网络建立
图7、基于CytoHubba插件实现的8种算法的Hub基因筛选
图8、Hub基因的鉴定和验证
5、评估候选生物标志物的诊断效能
为了验证5个Hub基因诊断OA的有效性，基于GSE55235和GSE55457数据集进行ROC逻辑回归分析。AUC值> 0.700被认为是有效和高度可靠的。发现VEGFA、FYN、GREM1、NRP1、IL6R的AUC值分别为0.947、0.795、0.768、0.775、0.776，(图9A ~ E)，表明这5个Hub基因诊断OA的敏感性和特异性较好。
图9、ROC曲线分析在GSE55235和GSE55457数据集中对OA诊断中5个Hub基因的验证
6、诊断性生物标志物与OA中浸润免疫细胞的关系
分析5个候选诊断生物标志物( VEGFA、FYN、GREM1、NRP1和IL6R)与9种差异浸润免疫细胞类型( a DC、星形胶质细胞、CD8 +初始T细胞、CMP、巨噬细胞、巨噬细胞M1、中性粒细胞、NKT、Th1细胞)之间的关系，通过r > 0.70和p < .05确定显著关系对(图10A )。VEGFA与CD8 + naïve T cells ( r = 0.852 , p < .001)呈显著正相关(图10B )，而VEGFA ( r = -0.840 , p = . 001)、FYN ( r = -0.765 , p = . 006)和IL6R ( r = -0.732 , p = .010)与M1型巨噬细胞(图10C ~ E)呈负相关。此外，NRP1与NKT ( r = -0.764 , p = . 009)呈负相关(图10F )，而NRP1 ( r = 0.700 , p = . 021)和GREM1 ( r = 0.764 , p = . 009)与a DC (图10G , H)呈正相关。
图10、候选诊断生物标志物与不同
浸润免疫细胞类型之间的关系
文章小结
这篇非肿瘤生信文章充分展现了生物信息学在非肿瘤研究中的应用和潜力。通过深入浅出的方式介绍了经典研究分析方法和结果解读，使得大家能够更好地理解该研究的思路和方法。同时，文章的简约风格也让人对其研究产生了浓厚的兴趣。这篇文章无疑为小白学习生信和应用提供了重要的参考。
小记者有话说
生信路公众号持续为大家带来最新生信思路，更多创新性分析思路请点击往期推荐，快来查看吧！想复现这种思路或者定制更多创新性思路欢迎直接call小记者，我们团队竭诚为您的科研助力！
1、注意！这个8分+『NHANES数据库分析友好期刊』On hold了！可能会被踢出SCI ···
2、7分+生信友好Nature子刊，质量过硬，影响因子看涨，但审稿速度拉垮，急稿建议绕行~
3、4分+中医药方向期刊，大量接收网络药理学！国人友好，审稿速度快，投稿看过来~