大家好，又到了每天和大家见面的时间啦!大家有没有想念小记者呀？小记者已经迫不及待地想要和大家分享新文章喽~ 现如今国家大力推进中医药事业发展，网络药理学是研究中草药非常好的切入点，我们要抓紧搭上“国潮”的顺风车。今天小记者跟小伙伴们分享一篇发文套路：网络药理学+分子对接+分子动力学，干湿结合，非常完整的网药思路，实验简单，极易复现的7分+SCI文章思路，赶紧学起来吧！本文首次通过体内和体外实验证明积雪草苷可以通过与NLRP3蛋白的相互作用来缓解MPTP诱导的PD症状。网络药理学是如何“卷”起来的？小记者带小伙伴们一起揭秘一下吧~
1. 选题创新：本研究从中草药成分出发，紧跟国家大力发展中医药的政策，通过网络药理学以及分子对接作为切入点，探讨了积雪草苷是如何缓解MPTP诱导的PD症状。
2. 思路完整：首先通过网络药理学预测AS对PD的作用靶点。下一步通过体内体外实验进行验证，最后通过分子对接阐明AS与NLRP3可能的结合模式，分子动力学验证对接模拟结果，这样的研究思路即完整又全面。
3. 性价比高：干湿结合，省时省力，实验简单易操作，以最快的速度，拿到一区7+SCI文章。(ps：如此简单粗暴，做完可以直接毕业的研究思路，还有不知道如何下手小伙伴可以来找小记者呀！感兴趣的直接扫码联系噢！)。
题目：积雪草苷通过靶向NLRP3炎症小体激活发挥神经保护作用
杂志：Phytomedicine
影响因子：IF=7.9
发表时间：2024年3月
研究背景
帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病，其特征是由于黑质(SN)和纹状体(STR)中多巴胺能神经元的进行性丧失以及神经炎症引起的运动症状。积雪草苷(Asiaticoside，AS)是从积雪草中提取的具有抗炎和神经保护作用的主要活性成分。然而，AS影响PD与炎症相关的确切机制尚不完全清楚。
数据来源
AS的化学结构和规范smile从PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载。将信息导入到PharmMapper服务器(https:// www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、相似性集成方法(https://sea.bkslab.org/)和Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)中，可以识别AS相关的目标。在遗传协会数据库(https:// www.genecards.org/)中使用“帕金森病”作为搜索词来确定帕金森病(PD)的潜在靶点。随后，通过使用Venny软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)分析两组靶点，确定AS和PD靶点的交集。使用STRING数据库(https://string-db.org/)分析蛋白质-蛋白质相互作用。使用Cytoscape软件(版本3.9.1)创建可视化表示，并对网络进行详细的拓扑分析。在线生物信息学平台(https://www.genedenovo.com/)上进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因本体(GO)途径富集分析，以阐明关键信号通路，并确定与AS潜在治疗靶点相关的生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。
研究思路
首先使用Swiss Target Prediction、Similarity Ensemble Approach和PharmMapper数据库预测了AS的潜在靶点。通过与PD相关靶点的交叉鉴定出17个治疗靶点，构建PPI网络，通过GO和KEGG分析预测AS对PD的作用靶点。下一步，通过动物行为学实验表明AS可以逆转MPTP对小鼠活动减弱的能力。通过Western Blot、 IHC染色实验、ELISA检测IL-1β表达水平可知AS可以有效地阻止MPTP引起的NLRP3炎性体激活，对PD小鼠产生神经保护作用。最后通过分子对接阐明AS与NLRP3可能的结合模式，分子动力学验证对接模拟结果，并分析NLRP3在配体结合后的分子运动。
主要结果
1. 网络药理学预测AS对PD的作用靶点
使用Swiss Target Prediction、Similarity Ensemble Approach和PharmMapper数据库共预测了95个AS的潜在靶点(图1B)。其中，通过与1147个PD相关靶点的交叉鉴定出17个治疗靶点(图1C和1D)。为了分析这些靶点之间的相互作用，基于数据构建了PPI网络,关键靶点包括NFκB1、TLR4、MAPK1和NLRP3(图1E)。进行GO富集分析以评估AS靶点的生物学功能，包括细胞成分、分子功能和生物过程(图1F)。此外，KEGG富集分析鉴定出149条通路，前25条富集通路表明AS可能通过多种信号通路影响PD，包括NOD样受体、C型凝集素受体和IL-17信号通路(图1G)。
使用Swiss Target Prediction、Similarity Ensemble Approach和PharmMapper数据库预测了AS的潜在靶点，通过与PD相关靶点的交叉鉴定出17个治疗靶点，构建PPI网络，通过GO和KEGG分析预测AS对PD的作用靶点。
图1. AS对PD的网络药理学分析
2. AS可改善MPTP诱导的PD小鼠的运动功能障碍
MPTP治疗可诱发PD样症状，为评价AS对PD模型小鼠的神经保护作用，采用开场试验评价其运动功能。在本实验中，以10 mg/kg和60 mg/kg体重给药的AS显著减轻了MPTP引起的运动功能障碍，小鼠的平均速度和总行驶距离恢复(图2B和2C)。观察小鼠的运动模式，MPTP处理的小鼠表现出活动减弱，其运动主要集中在开放区域的中心，AS治疗表现出明显更大的活动范围(图2D)。这些发现共同表明，AS具有逆转MPTP影响小鼠运动功能障碍的强大能力。
通过动物行为学实验表明AS可以逆转MPTP对小鼠活动减弱的能力。
图2. AS可改善MPTP诱导的PD小鼠的运动功能障碍
3. AS可减轻MPTP诱导的PD小鼠多巴胺能神经元损失
MPTP诱导多巴胺能神经元进行性变性，SN和STR神经递质显著减少，这是PD的标志性特征。随后的分析显示，MPTP给药后，SN和STR的多巴胺能神经元数量显著减少。值得注意的是，这种效应的特点是Th阳性神经元的损失，表明多巴胺能神经元损伤。然而，AS治疗减轻了这些影响，证明了STR和SN中TH阳性神经元数量的保留(图3D和3E)。此外，AS恢复了MPTP诱导的PD小鼠STR和SN脑区TH的表达(图3A和3B)。神经炎症在PD进展中起关键作用，PD小鼠SN中iba1阳性细胞(活化的小胶质细胞)显著增加(图3F)，这是MPTP诱导的神经炎症的标志。然而，AS治疗降低了SN的小胶质细胞激活和Iba1表达(图3C和3F)，突出了其在缓解PD神经炎症中的潜在作用。总的来说，这些发现表明AS对PD小鼠具有神经保护作用，主要是通过抑制神经炎症。
通过Western Blot和IHC染色实验结果可知AS通过抑制神经炎症对PD小鼠有神经保护作用。
4. AS在体内抑制NLRP3炎性体的激活
网络药理学分析表明，NOD样受体信号通路可能是AS治疗PD的关键靶点。为了验证这一假设，作者在体内研究了AS对NLRP3炎性体激活的调节作用。与对照组相比，MPTP给药显著上调了NLRP3、pro-IL-1β、p20和p17的表达，表明NLRP3炎症小体被激活。AS处理明显抑制了这种激活，SN中p17和p20的表达减少证明了这一点(图3G)。此外，使用ELISA检测细胞因子IL-1β水平，AS治疗显著降低了MPTP引起的SN中IL-1β水平升高(图3H)。总之，这些发现表明AS有效地阻止MPTP触发的NLRP3炎性体激活。
通过Western Blot和ELISA检测IL-1β表达水平可知AS可以有效地阻止MPTP引起的NLRP3炎性体激活。
图3. AS通过调节NLRP3通路减轻MPTP诱导的PD小鼠多巴胺能神经元损失
5. AS抑制小胶质细胞NLRP3炎性体的激活
为了证实AS对NLRP3炎性小体激活的直接作用，采用LPS联合ATP的体外模型。AS在浓度高达200 μM时对细胞无毒(图4A)。BV2细胞用1 μg/ml LPS孵育3小时，随后用2.5 mM ATP孵育1小时，表现出明显的NLRP3炎性体活化，其特征是细胞中NLRP3和pro-IL-1β表达增加，上清中p17和p20水平升高。在LPS暴露前，用不同浓度的AS预处理BV2细胞1小时，可显著降低上清液中p17和p20的水平，这表明AS抑制NLRP3炎性体的激活，减少细胞因子IL-1β的释放。此外，AS治疗并没有降低NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β的表达(图4B)。RT-qPCR分析结果显示AS不影响LPS诱导的NLRP3和IL-1β mRNA水平升高(图4C和4D)。基于这些发现，假设AS可能通过直接结合NLRP3蛋白来抑制NLRP3炎性体。这一假设得到了CETSA结果的支持，该结果表明，虽然温度升高会促进NLRP3蛋白的分解，但AS的存在减轻了这种降解(图4E)。因此，AS通过与NLRP3蛋白的直接相互作用阻碍NLRP3炎性体的激活。
体外实验采用LPS联合ATP对BV2细胞造模得出了AS是与NLRP3蛋白的直接相互作用从而阻碍NLRP3炎性体的激活的结论。
图4. AS抑制BV2细胞NLRP3炎性体活化
5. 分子对接研究与分子动力学
通过分子对接，阐明AS与NLRP3可能的结合模式。经MOE软件分析表明AS具有较高的亲和力。已知RMSD值的最佳分数应接近2 Å，能量分数小于或等于-7 kcal/mol。这两个值常被用作验证分子对接结果的标准。利用整体对接图和三维相互作用图对综合体的对接图进行了详细分析。结果表明，AD与NLRP3活性位点结合，氢键和疏水相互作用在结合过程中起主要作用(图5A和5B)。为了探索蛋白质-配体复合物的稳定性和动态相互作用，进行了MDs来验证对接模拟结果，并分析NLRP3在配体结合后的分子运动。对接复合物进行了100 ns的模拟，在此过程中温度、动能和势能保持稳定(图5E和5F)。AS的RMSD在1.50 ~ 2.00 Å之间波动，而蛋白质的RMSD在2.50 ~ 3.00 Å之间波动(图5D)。用MM/PBSA法和MM/GBSA法计算了配合物的总结合自由能，表明AD与NLRP3具有较强的结合能力。VDW和EE能量对结合有很大贡献。为了确定参与NLRP3蛋白结合的关键氨基酸残基，对氨基酸残基进行了能量分解。能量贡献值低于-1 kcal/mol的氨基酸残基，表明ARG578、PRO352和ALA228是结合自由能的主要贡献者(图5C)。
通过分子对接阐明AS与NLRP3可能的结合模式，分子动力学验证对接模拟结果，并分析NLRP3在配体结合后的分子运动。
图5. AS与NLRP3的分子对接研究及MD模拟
文章小结
这篇文章将中草药成分研究与网络药理学进行了完美结合，再叠加分子对接和分子动力学，双层“buff”。研究思路非常清晰完整，生信分析方法容易，实验简单，省时省力，轻松打造出一区7分+ SCI。中医药方向的小伙伴要赶紧抓住机会，利用生信助攻中医药实验研究，缩短研究周期，尽早发文，中草药成分发表SCI so easy！你是不是也迫不及待准备大展身手啦？小记者一定为你提供比张元英转圈还丝滑的研究思路，风里雨里小记者还在等你，需要思路设计、生信分析随时联系我哟~
文章索引：
Asiaticoside exerts neuroprotection through targeting NLRP3 inflammasome activation
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324001582?via%3Dihub
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