担心创新点不够？看这里！单细胞数据分析+ATAC-Seq+血管生成，多种亮点集合闪瞎眼！干湿结合，非肿瘤也能发到8分+！- 大数跨境

担心创新点不够？看这里！单细胞数据分析+ATAC-Seq+血管生成，多种亮点集合闪瞎眼！干湿结合，非肿瘤也能发到8分+！

生信日报

2023-06-08

导读：担心创新点不够？看这里！单细胞数据分析+ATAC-Seq+血管生成，多种亮点集合闪瞎眼！干湿结合，非肿瘤也能发到8分+！

小记者之前分享的文章大多数都是肿瘤相关的研究，当然了，肿瘤相关的研究也是相对来说比较容易发高分文章的。今天这篇文章发表于J Transl Med，研究着眼于颌骨髓与长骨髓之间的血管生成差异，看起来似乎“平平无奇”，“只是”把研究对象从“免疫细胞”转到了“血管生成”，光从文章题目上来看，各种生信套路在布小谷脑海里呼啸而过，心中已然有数，不过令小记者失算的是，该篇文章竟跳出了小记者熟知的套路！它结合了scRNA-seq、RNA-seq 和 ATAC-seq分析，并做了细胞水平的PCR、WB等实验验证，尤其是用到了ATAC-seq分析，研究思路上狠狠创新了一把，是本文的一大亮点。

有小伙伴可能不太了解ATAC-seq，它属于表观基因组学的范畴，是利用转座酶Tn5在开放染色质区域插入测序适配子，通过测序揭示基因组中的可访问性。ATAC-Seq也被应用于定义人类癌症中全基因组染色质可及性情况，可以在ATAC-seq上运用计算足迹方法，以找到具有细胞特异性活性的细胞特异性结合位点和转录因子。接下来和小记者一起看一下这篇文章的具体内容吧！

题目：基于单细胞 RNA 测序、RNA-seq 和 ATAC-seq 分析，Atf4 通过调节 M1 极化来调节牙槽骨和长骨巨噬细胞之间的血管生成差异

杂志：J Transl Med

影响因子：IF=8.44

发表时间：2023年3月

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研究背景

在颌面骨缺损修复中，自体颅面骨移植往往能够提供比长骨移植更好的临床效果。目前大部分研究关注于牙槽骨髓（ABM）与长骨髓（LBM）之间的成骨差异，然而对两者之间的血管生成差异的研究目前还很有限。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	详细信息
PRJNA697839	ENA	scRNA-seq数据	4个小鼠的牙槽骨髓
GSE109774	GEO	scRNA-seq数据	小鼠长骨髓
GSE183565	GEO	RNA-seq处理表达矩阵	3个正常小鼠样本、3个LPS刺激的小鼠样本
PRJNA761334	ENA	原始 ATAC-seq 数据	3个正常小鼠的样本、3个LPS刺激的小鼠样本

研究思路

从公共数据库下载了小鼠ABM和LBM的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，并使用Seurat软件包对数据进行处理。应用CellphoneDB2进行细胞间通讯研究，以发现细胞簇之间潜在的配体-受体关系；应用 SCENIC 分析来探索调节 ABM 和 LBM 巨噬细胞之间差异的关键转录因子；通过对M1巨噬细胞进行转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）数据和RNA表达谱数据的分析证实了Atf4对M1极化的调控作用；最后通过PCR、WB 和血管生成实验来证实Atf4可以调节M1极化。

图1 技术路线

主要结果

1. ABM单细胞测序数据的处理及数据特征

使用合并后的4个ABM样本的原始数据进行分析，使用FindVariableFeatures函数，从18,445个特征中选择了2000个可变特征。应用tSNE和UMAP方法，将这些细胞分成11个聚类注释（图2A），不同细胞类型聚类中标记物的表达如图2B、C所示。使用FindAllMarkers函数，挑选出5734个高变异基因，分离出间充质细胞聚类，并将其分成四个亚聚类（MSCs的Lepr，成骨细胞的Bglap，内皮细胞的Cdh5，神经细胞的Plp1），如图2D、E所示。

图2 ABM 单细胞图谱的表征

2. 配体-受体相互作用分析

Heatmap结果表明，巨噬细胞与其他细胞之间有广泛的相互作用，其中与间充质干细胞（MSCs）和内皮细胞（ECs）的相互作用最强（图3A）。环形图中显示了13个细胞亚聚类之间的相互作用网络（图3B）。探索了巨噬细胞、MSCs和ECs之间相互作用中的重要细胞因子，并根据它们的表达均值绘制了相应图表（图3C）。在巨噬细胞和MSCs的相互作用中，预测到Vegfa-Nrp1/Nrp2和Tgfb1-Tgfbr2/Tgfbr3的相互作用，而在巨噬细胞和ECs的相互作用中，预测到Vegfa-Kdr/Flt1、Tgfb1-Tgfbr1/Tgfbr2/Tgfbr3、Tnf-Tnfrsf1a/notch1、Ccl2/Ackr1的相互作用。

图3 ABM中不同细胞类型之间的细胞间相互作用

3. LBM scRNA-seq的处理及ABM与LBM的比较

处理LBM的scRNA-seq数据，使用巨噬细胞标记物Ahnak、Mpeg1、Cd68、Csf1r分离巨噬细胞聚类（聚类3）并合并ABM与LBM巨噬细胞聚类，ABM和LBM巨噬细胞中上述关键细胞因子（Vegfa、Ccl2、Tnf、Tgfb1）的分布显示在图4A中。PCR的结果（图4B）表明，只有Vegfa在ABM巨噬细胞中的水平显著高于LBM巨噬细胞，对于血管生成因子Vegfb、Vegfc、Vegfd和Fgf2的表达在ABM巨噬细胞中均显著高于LBM巨噬细胞（图4F）。ELISA结果进一步确认ABM巨噬细胞培养基中的Vegfa含量高于LBM巨噬细胞培养基（图4C）。Western blot结果也显示，ABM巨噬细胞中Vegfa的蛋白含量高于LBM巨噬细胞（图4D，E）。

图4 在 ABM 巨噬细胞中高表达的 Vegfa

4. LBM 和 ABM 巨噬细胞的转录调节因子分析和极化状态差异

使用SCENIC分析探索可能导致ABM巨噬细胞和LBM巨噬细胞之间差异的转录调节因子（Transcriptional Regulators）。热图结果显示Cebpb、Klf3和Klf4等在ABM巨噬细胞中的活性较LBM巨噬细胞更高（图5A）。图5B展示了这六个调节因子在tSNE维度中的细胞活性分布，绘制了显示这六个调节因子及其相应靶基因的网络，并发现Vegfa受Klf4、Fosl2和Atf4共同调控（图5C）。图5D显示了这六个调节因子在ABM和LBM巨噬细胞中的分布情况。PCR结果表明，只有Atf4的水平在ABM巨噬细胞中显著高于LBM巨噬细胞（图5E），这也得到了WB验证（图5F, G）。根据WB结果，iNOS（M1极化标志物）的蛋白含量在ABM巨噬细胞中高于LBM巨噬细胞，而Arg1蛋白水平则相反（图5H，I，J）。

图5 使用SCENIC和两者之间的极化状态差异鉴定ABM和LBM巨噬细胞中的TF靶基因相互作用

5. M1巨噬细胞的ATAC-seq和RNA-seq分析

下载了50 ng/mL LPS刺激（M1极化）小鼠BMDM的 ATAC-seq和RNA-seq数据。图6A展示了大部分可访问区域位于转录起始位点（TSS）的2 kb范围内，表明染色质可访问区域参与转录调控。通过Diffbind处理数据，发现有19,021个峰值位于启动子区域，将从增加开放性的19,021个峰值中注释得到的8579个基因与RNA-seq获得的3670个上调基因进行交集运算，得到2564个由于LPS刺激下增加的染色质开放性而表达增加的基因（图6G）。对这8050个峰值进行de novo motif分析，找到了39个转录因子并展示了包括Atf4在内的前20个（图6H）。综合考虑SCENIC结果及其他实验结果，假定激活转录因子4（Atf4）可能是一个通过调节M1极化来调控ABM和LBM之间的血管生成差异的关键因子。

图6 小鼠M1BMDM的ATAC-seq和RNA-seq分析

6. ABM和LBM巨噬细胞的血管生成作用的差异

ABM和LBM细胞上清均促进了MSC向EC的转化，具有Cd34代表性标记，而ABM上清的效果更为显著（图7A）。在管状结构形成分析中，两者上清都能促进管状结构的形成，而ABM的促进效果更为显著（图7B），同时伴随着网格数的增加（图7C）。至于ECs，ABM巨噬细胞相较于LBM巨噬细胞也引起了更多的管状结构形成（图7D, E）。在进行Vegfa中和后，ABM和LBM上清表现出类似的促进MSC向EC转化的能力（图7A）和管状结构形成（图7B- E）。

图7 ABM和LBM巨噬细胞的血管生成作用的差异

7. Atf4是一种潜在的TF，可通过M1极化调节ABM和LBM之间的血管生成差异

在向ABM和LBM巨噬细胞中添加抑制Atf4的siRNA后，iNOS的表达显著降低（图8A），ABM和LBM之间的极化差异也减少。PCR结果（图8B）和WB结果（图8C，D）也证实通过抑制Atf4可降低Vegfa的表达。向巨噬细胞的培养基中添加50 ng/mL的LPS和300 μg/mL的IFN-γ能促进M1极化，被抑制的Atf4、iNOS和Vegfa的表达得以恢复（图8A-D）。MSCs（图8E，F）和ECs（图8G，H）的管状结构形成也被siRNA（Atf4）所抑制，但在添加LPS和IFN-γ后得以逆转。此外，额外添加M1极化因子可以消除ABM和LBM巨噬细胞之间的血管生成差异（图8E-H）

图8 Atf4 通过 M1 极化调节 ABM 和 LBM 巨噬细胞之间的血管生成差异

文章小结

这篇文章研究了牙槽骨和长骨巨噬细胞之间的血管生成差异，结合了scRNA-seq、RNA-seq 和 ATAC-seq分析，相比目前流行的模式化思路，在研究思路上大大创新，但归根结底还是要挖掘到目标基因。除了进行PCR和WB实验验证外，这篇文章还进行了血管生成实验，很好地结合了生信和实验，从不同角度验证了研究结果的可靠性。生信分析的手段有很多，根据自己的研究目的可以组合出各种研究思路，并没有定式，也欢迎大家和布小谷一起进行探讨呀！