特色数据库构建、免费思路评估、
付费生信分析
叮咚！小记者准时上线咯~~各位新老朋友们大家好呀！PubMed冲浪老手的小记者继续为大家挖掘宝藏好文~~赶紧来一起瞅瞅今日份文章能给你带来什么样的好思路吧！！
今天这篇文章鉴定了肝细胞癌中预后相关的lncRNA，通过回归分析构建了预后模型并讨论其预后价值。接着研究了关键的lncRNA与m6A基因之间的关联，探索了中枢lncRNA的功能（免疫浸润、药物敏感性等）。最后利用临床样本验证了目标lncRNA的表达和其与肝细胞癌进展的关系。文章整合了多组公共数据集，分析内容丰富充实，方法多样，思路简单清晰，再加简单实验（PCR、CCK8等）发到2区5分+相当轻松！！心动的小伙伴们赶紧收藏复现吧！（ps：没有思路、不知道怎么创新的找小记者，超多新颖的分析思路供你选择哦！）
杂志：Frontiers in Pharmacology
影响因子：IF=5.6
肝细胞癌（HCC）是最致命的恶性肿瘤：肝细胞癌（HCC）是最致命的恶性肿瘤。长非编码RNA（lncRNA）参与了多种人类恶性肿瘤的发展。本研究旨在为HCC患者建立可靠的特征并确定新的生物标志物。
数据来源
从基因表达总库（GEO）和癌症基因组图谱（TCGA）数据库中鉴定差异表达的lncRNAs（DElncRNAs）。应用单变量、LASSO和多变量Cox回归分析筛选预后lncRNAs并建立预后模型。
通过接收者操作特征曲线（ROC）和Kaplan-Meier分析来验证该模型的预后价值。通过Spearman分析法分析了lncRNA与不同m6A基因之间的关联。应用ceRNA网络、功能富集分析、免疫浸润和qRT-PCR、CCK8等体外实验来探索中枢lncRNA的功能。
HCC患者中DElncRNA的鉴定
从9个GEO微阵列数据集中选取了142对HCC患者样本，以确定lncRNAs在HCC肿瘤组织和邻近正常肝组织中的表达水平。如图1A所示，在GEO数据库中发现了51个上调的lncRNA和58个下调的lncRNA。同时，在TCGA数据库中获得的374个HCC肿瘤样本和50个正常肝组织中发现了322个调控异常的lncRNA（35个上调，287个下调）（图1B）。然后将两个平台的DElncRNAs进行汇聚，最终得到了32个在GEO和TCGA数据库中均显著失调的lncRNAs（图1C）。
图1 HCC中DElncRNA的鉴定
结合预后信息，单变量Cox回归分析从上述两个数据集中的32个失调lncRNA中筛选出与预后相关的lncRNA。最后，在两个数据集中发现12个lncRNA与HCC患者的预后相关（图2A）。如图2A所示，LINC02428、AC008549.1、AC115619.1和LINC02362是HCC患者的保护因子；而AC092171.2、GIHCG、CRNDE、ST8SIA6-AS1、AL365181.3、LINC02163、LINC00665和CASC9是危险因子。
热图显示了上述12个与预后相关的lncRNA在TCGA数据集中的表达变化（图2B）。为了更准确地识别预后相关的lncRNAs，基于这12个预后相关的lncRNAs进行了LASSO Cox分析，并利用降维方法筛选出了6个关键lncRNAs（即LINC02428、LINC02163、AC008549.1、AC115619.1、CASC9和LINC02362）（图2C、D）。
然后，进一步进行了多重逐步Cox回归分析，以评估哪种lncRNA结合在一起对HCC患者的预后贡献最大。结果显示，AC008549.1、AC115619.1和CASC9被认为是HCC患者的独立预后因素（图2E）。这些lncRNA在肿瘤组织中的表达水平与正常组织相比也有不同（图2F、G）。
图2 鉴定与预后相关的DElncRNAs
建立预后风险模型
根据多变量Cox回归模型中六个预后lncRNAs的每个系数，计算出TCGA数据集中每个HCC患者的风险评分。然后，利用这六个lncRNA建立了一个新的预后特征。根据风险评分的中位值，将训练组和测试组的患者分为低风险亚组和高风险亚组。Kaplan-Meier生存曲线显示，高风险评分的HCC患者预后较差（图3A、E）。
生存状态分布表明，高风险评分组患者的死亡率高于低风险评分组患者（图3B、F）。热图显示，预后相关lncRNA的表达水平高于低风险评分患者（图3C、G）。为了评估该预后风险模型的预测准确性，研究人员还绘制了ROC曲线，结果表明预后相关lncRNA具有预测OS的潜在能力（训练队列：1年AUC=0.711；测试队列：1年AUC=0.743；图3D、H）。
还利用单变量Cox回归分析了风险评分和患者临床特征（包括年龄、性别、分级和分期）的预后价值。结果显示，模型中的分期和风险评分与HCC患者的不良预后呈正相关（图4A、C）。此外，多变量Cox回归表明，分期和风险评分是HCC患者的独立预后因素（图4B、D）。
图3 验证预后风险模型的临床意义
新的证据表明，RNA修饰在lncRNA的表达和功能中发挥着重要作用。N6-甲基腺苷（m6A）是RNA中最丰富的修饰，m6A调控因子通过调控各种生物过程对HCC做出了贡献。为了阐明m6A甲基化与预后相关lncRNA的关系，从TCGA数据集中进行了单变量Cox回归，以筛选HCC患者中预后相关的m6A调节因子。
结果显示，12个m6A调控因子与HCC患者的预后显著相关（图4E），热图描述了它们在肿瘤组织和正常组织中的表达变化（图4F）。皮尔逊相关系数（Pearson's correlation coefficient）进一步分析了预后m6A相关调控因子与预后特征中获得的6个预后lncRNA之间的关系（图4G）。发现m6A相关调节因子RBMX与预后lncRNA AC115619.1显著相关（图4H）。
图4 风险评分的临床意义分析以及m6A和lncRNAs的相关性分析
在公共数据库中验证中枢lncRNA AC115619.1的潜在意义
由于AC115619.1对HCC预后有显著影响，与m6A相关调控因子RBMX密切相关，且从未在HCC中报道过，因此我们选择AC115619.1作为中枢lncRNA进行进一步研究。
随后，利用GEO数据库中的四个数据集来验证lncRNA AC115619.1在HCC患者中的表达。GSE84004、GSE93789、GSE115018和GSE138178数据集均显示，lncRNA AC115619.1在HCC肿瘤组织中的表达量明显低于正常组织（图5A-D）。进一步分析了AC115619.1的高低表达与TCGA数据库中HCC患者临床病理特征的关系。
如表2所示，AC115619.1的表达与肿瘤分级、肿瘤浸润和TNM分期相关。然而，AC115619.1的表达与年龄、性别、淋巴结转移和远处转移（表2）无关。还验证了从TCGA数据库中获得的不同子集在HCC患者中的临床意义。结果发现，lncRNA AC115619.1的表达与肿瘤分级、肿瘤侵犯以及部分TNM分期呈负相关（图5E-G）。
此外，还估算了lncRNA AC115619.1在预测患者OS方面的预后价值，如图5H所示。Kaplan-Meier曲线显示，AC115619.1高表达的HCC患者显然有更好的OS（图5H）。这些数据表明，AC115619.1在HCC中具有肿瘤抑制作用。
图5 验证lncRNA AC115619.1的表达和临床价值
表2 TCGA数据集中AC115619.1在HCC组织中的表达与患者临床病理特征的相关性
构建ceRNA网络和功能富集分析
还通过miRcode数据库构建了一个ceRNA网络，以探索AC115619.1的潜在相互作用miRNA。发现有11个miRNA与lncRNA AC115619.1存在相互作用位点。结合miRDB、miRTarBase和TargetScan数据库，进一步筛选了可能与AC115619.1有相互作用的miRNA的靶mRNA。为了更准确地预测靶mRNA，这些筛选出的mRNA与从TCGA数据库中获得的HCC差异表达mRNA（DEmRNA）进一步交叉。
最终共鉴定出5个miRNA，即miR-212-3p、miR-129-5p、miR-301b-3p、miR-449c-5p和miR-137，它们可能调控60个DEmRNAs（图6A）。为了进一步研究lncRNA AC115619.1的生物学意义和生物学途径，进行了GO和KEGG分析。GO分析显示，AC115619.1的生物学过程主要与ATP酶活性、转录共调控活性和小管蛋白结合有关（图6B）。
KEGG通路分析表明，AC115619.1参与了内吞作用、细胞周期和剪接体的通路（图6C）。
图6 AC115619.1的功能富集分析
患者对化疗和靶向治疗的反应以及AC115619.1的免疫细胞浸润情况
为了促进潜在的临床应用，根据pRRophetic R软件包提供的算法预测了AC115619.1高表达组和低表达组常用化疗和靶向药物的IC50值。AC115619.1高表达组HCC患者的5-氟尿嘧啶、吉西他滨、紫杉醇、雷帕霉素、伊马替尼、索拉非尼、舒尼替尼和维诺雷滨的IC50值更高，表明AC115619.1低表达组HCC患者对这8种药物更敏感（图7A-I）。
此外，还提供了详细的相关性（图8A-I）。新的证据表明，免疫微环境在肿瘤进展中起着重要作用。还使用CIBERSORT算法研究了高AC115619.1表达和低AC115619.1表达患者的肿瘤免疫细胞浸润比例。结果显示，记忆B细胞、CD4记忆静息T细胞、T滤泡辅助细胞和M0巨噬细胞在AC115619.1高表达亚组和低表达亚组中显著富集（图8J）。
图7 预测AC115619.1在HCC中的药物IC50值
图8 AC115619.1的药物敏感性和免疫细胞浸润分析
临床样本中lncRNA AC115619.1和RBMX的验证
为了验证AC115619.1在临床样本中的表达，在收集的43对HCC样本中使用qRT-PCR检测了其表达水平。结果表明，与邻近的正常组织相比，AC115619.1在大多数HCC肿瘤样本中的表达均呈下调趋势（图9A）。
在43对HCC患者样本中，27例正常肝组织中AC115619.1的表达高于HCC样本（图9A）。为了进一步评估AC115619.1与m6A相关调节因子RBMX之间的相关性，对这43对HCC样本进行了免疫组化染色。如图9B所示，IHC染色的典型图片显示RBMX定位于细胞核中，且肿瘤组织中RBMX的表达高于邻近的正常肝组织，这与HCC中AC115619.1的表达呈负相关（图9B）。
图9A-B AC115619.1与RBMX呈负相关，可抑制HCC的进展
过表达AC115619.1可抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭
由于AC115619.1在HCC组织中表达下调，且AC115619.1的低表达与HCC患者的不良预后密切相关，使用SNU-449和HepG2细胞系进行了进一步的实验。质粒转染后，AC115619.1的表达水平显著上调，qRT-PCR证实了这一点（图9C）。CCK-8和EdU检测表明，过表达AC115619.1可抑制HCC细胞的增殖（图9D、E）。
此外，伤口愈合迁移和Transwell侵袭实验表明，过表达AC115619.1抑制了SNU-449和HepG2细胞的迁移和侵袭能力（图9F、G）。综上所述，研究结果表明AC115619.1可抑制HCC的进展。。
图9C-G AC115619.1与RBMX呈负相关，可抑制HCC的进展
这项研究为HCC患者提供了一个有希望的预后特征，并发现AC115619.1是一种新型生物标志物，在调节HCC的进展中发挥着重要作用。文章整合了多组GEO和TCGA数据集，通过回归分析构建预后模型。还探讨了lncRNA与不同m6A基因之间的关联，分析了中枢lncRNA的功能。
最后利用临床样本验证关键lncRNA的表达，以及与HCC进展的关联。文章收集了丰富的数据量，分析方法和工具多样，内容充实，思路简单清晰，又有临床样本验证，干湿结合发到2区5.8分一点也不困难！生信发文还缺好思路的小伙伴们不妨跟着学起来吧！
如果您的时间和精力有限或者缺乏相关经验，并且对生信分析和课题设计有所需要的话，【生信日报】可以提供特色数据库构建、免费思路评估、付费生信分析和方案设计以及实验项目实施等服务，感兴趣的朋友可以咨询小记者哦！
扫码咨询小记者吧！
●铁死亡在非肿瘤纯生信分析中仍然强劲！轻松拿下4分+的套路快来试试！性价比超高！！
●最新12分+GWAS双疾病纯生信分析！工作量不大，重在方法创新
●中科院1区Top 11分+【生信&孟德尔随机化友好期刊】，柳叶刀子刊，想冲刺高分的朋友们看过来!
●孟德尔随机化与单细胞分析强强联手，再加动物模型验证，4张主图教你如何拿捏8分+！赶紧上车！！