单细胞测序可谓如火如荼，可惜既要收集样本，有需要高昂的测序费用，限制了很多小伙伴。有没有可以更好的切入手段？今天小记者跟小伙伴们分享一篇高分单细胞数据挖掘类文章，整篇文章不用自己测序，不用做实验，只采用了GEO数据集的单细胞转录组、大量RNA-seq和微阵列数据，揭示了骨肉瘤的异质性和潜在机制，有助于OS评估和在选择最佳治疗方法起着不可或缺的作用。这篇文章为什么能发表7分+呢？小记者带小伙伴们一起揭秘一下吧~
本研究以单细胞高分辨率绘制了人胚胎长骨、正常骨组织和骨肉瘤的单细胞RNA序列，以研究骨肉瘤的发展和肿瘤细胞的异质性。综合生物信息学分析结果确定并验证了成骨不完善的过程、潜在的新驱动基因、异常信号通路、转录组异质性和骨肉瘤的靶向治疗药物。想要发表高分SCI的小伙伴们也可以借鉴一下本文的研究思路哦~(ps：不知道怎么创新的小伙伴可以来找小记者！这里有新鲜出炉的生信热点方向，还有一大波可复现的创新思路，感兴趣的直接扫码联系噢！)。
题目：骨肉瘤的异常信号通路与肿瘤异质性
杂志：J Transl Med
影响因子：IF=7.4
发表时间：2023年2月
研究背景
骨肉瘤是一种极具侵袭性的肉瘤，几十年来其治疗策略没有实质性进展。骨肉瘤的发病机制可能与骨细胞内的遗传异常、肿瘤抑制通路、端粒酶和选择性端粒延长(ALT)的改变有关。然而，对骨肉瘤（OS）发育的分子机制尚不清楚，迫切需要新的分子靶点来改善患者的预后。
数据来源
数据集/队列 |
数据库 |
数据类型 |
详细信息 |
GSE143753 |
GEO |
scRNA-seq数据 |
8周龄长骨 |
GSE196678 |
GEO |
scRNA-seq数据 |
人类正常骨组织 |
GSE162454 |
GEO |
scRNA-seq数据 |
骨肉瘤 |
GSE33383 |
GEO |
基因表达谱 |
12间充质干细胞, 3个成骨细胞和84个骨肉瘤样本 |
GSE19743 |
GEO |
基因表达谱 |
53例骨肉瘤患者 |
GSE84500 |
GEO |
基因表达谱 |
|
研究思路
本研究首先从GEO获得人胚胎长骨、正常骨组织和骨肉瘤的单细胞RNA数据集。使用Seurat v4.0和MPLAB Harmony v1.0分析了scRNA-seq数据，发现骨肉瘤是由发育过程中成骨发育不完全引起的。使用Monocle3构建单细胞轨迹分析，并由ClinVar数据库确定了IFITM5是骨肉瘤的潜在新驱动基因。下一步在12个MSCs、3个成骨细胞和84个OS样本中检索公开表达谱。利用WGCNA构建共表达网络，鉴定共表达基因集。通过重新聚类分析骨相关肿瘤细胞的转录组异质性，发现了6个不同的转录组亚型。使用GSVA评估每个亚群的前100个基因特征，进一步确定了IFITM5高表达与较短的总生存期亚群相关。经过主成分分析和微阵列数据揭示了TGF-β异常表达使得脂肪细胞无法分化为正常骨细胞，阻碍了脂肪细胞的发育，导致了骨肉瘤的脂肪细胞样亚型。最后，通过DrugMatrix、以及GSEA对骨肉瘤细胞转录组的分析发现依托泊苷有望通过促进免疫原性亚型，抑制脂肪细胞样亚型，纠正异常的细胞周期和P53信号通路，是一种在治疗骨肉瘤方面具有潜力的化疗药物。
主要结果
1. 骨肉瘤（OS）起源于成骨发育不完全
作者整合了来自3个单细胞数据集中的8周龄长骨、人类正常骨组织和OS的数据，得到60,553个细胞用于下游分析。基于UMAP细胞聚类分析鉴定出髓系、淋巴系、内皮细胞、肌源性和骨相关细胞簇(图1A)。基于谱系标记(图1B)，根据组织来源将它们分开。骨间充质干细胞(BMSCs)、正常骨细胞和OS肿瘤细胞被定位在一起，这表明肿瘤细胞可能来源于骨髓间充质干细胞(图1C)。比较转录谱后，鉴定出349个DEGs，其中143个在OS肿瘤细胞中升高(图1D)。使用MGI哺乳动物表型和Jensen疾病数据库分析上调的DEGs，发现致密骨厚度减少，小梁骨体积减少，长骨长度减少，成骨不全(图1E和1F)。
图1 骨肉瘤起源于发育过程中的成骨不全
2. 干扰素诱导的跨膜蛋白5 (IFITM5)是一个潜在的新的OS发展驱动基因
骨相关细胞的起源和发育轨迹(图2A和2B)揭示了部分骨髓间充质干细胞，并且IFITM5在骨肉瘤的肿瘤发生过程中发挥了至关重要的作用(图2C)。此外，在正常骨细胞和OS肿瘤细胞的DEGs中，IFITM5从BMSCs到OS显著增加(图2D)，说明IFITM5基因随着细胞沿癌细胞轨迹的进展而改变。因此，了解IFITM5变化的顺序导致了新模型的产生(图2E和2F)。
使用Simple ClinVar确认IFITM5变异，总结了IFITM5的各种突变类型，发现错义突变是最常见的类型(图2G)，根据Simple ClinVar数据集和现有文献(图2H)，ITITM5的三种变异可导致致病性状态。这些发现都表明IFITM是OS发展的潜在新驱动基因。
图2 IFITM5是一个潜在的新的OS发展驱动基因
3. 骨肉瘤的发生与发育过程中异常信号通路的复杂调控有关
通过分析12个MSCs、3个成骨细胞和84个OS样本的表达谱，进一步研究了OS的发展。利用WGCNA建立了相关网络并鉴定共表达模块。使用动态树切算法获得了9个共表达模块，共包含4637个基因(图3A)。聚类树主要显示了两个分支(图3B)。模块与MSCs、成骨细胞和OS样本之间的相关性如图所示(图3C)。热图显示MEgreen和MEblue模块与MSCs和成骨细胞呈负相关，与OS呈正相关。MEgery模块与MSCs和成骨细胞呈正相关，与OS呈负相关。
作者使用MEgreen、MEblue和MEgery共表达基因分析BioPlanet通路。每个模块中三个最重要的通路，即细胞周期、抗原加工和递呈以及TGF-β对细胞外基质的调节被富集(图3D-F)。与OS相比，MSCs的模块相关系数与成骨细胞的模块相关系数一致(图3G和3H)。OS归因于细胞周期和抗原加工和递呈途径的构成性激活，以及TGF-β对细胞外基质信号的调节不足。非典型信号通路也具有调节骨发育的复杂连接(图3I)。
图3 骨肉瘤的发生与发育过程中异常信号通路的复杂调控
4. 肿瘤细胞的转录组异质性
通过对骨相关细胞在骨肉瘤中重新聚类，分析了骨相关肿瘤细胞的转录组异质性，发现了6个不同的转录组亚簇(图4A)。COL1A1、COL1A2、ALP的阳性表达和CD45的缺失表明，这6个亚簇是骨相关肿瘤细胞。CNV使用intercnv(以肌源性细胞为参照)估计，以区分肿瘤细胞和正常细胞(图4B)。
来自scRNA-seq的CNV显示，与参比细胞相比，所有亚群中都有许多变化(图4C)。作者确定了六个亚群中差异表达最多的100个转录本，并在基因集富分析中定义了它们的细胞类型。热图显示每个亚群中的中心基因(图4D)。
使用GSVA评估每个亚群的前100个基因特征，并从53个人类转录组谱中估计肿瘤细胞亚型丰度。Kaplan - Meier估计，较高的免疫原性和脂肪细胞样评分与较长的无进展生存期相关，而与不良预后相关(图4E)。因此，IFITM5的高表达与较短的总生存期亚型相关，这与之前的研究一致
。
图4 肿瘤细胞的转录组异质性
5. TGF - β信号缺失导致发育过程中的脂肪细胞样OS亚型
由于脂肪细胞样OS亚型与预后不良相关，作者分析了存在脂肪生成/成骨因子(GSE84500)的人间充质干细胞(hMSCs)中的基因表达。hMSC_BMP2 + IBMX与hMSC_BMP2 + IBMX + TGF-β转录谱的比较主成分分析(PCA)揭示了相关性(图5A)。确定了469个上调转录本，其中240个在hMSC_BMP2 + IBMX组中升高，并在PanglaoDB增强数据集中命名为脂肪细胞。229个在hMSC_BMP2 + IBMX + TGFβ组中大量表达，并标记了软骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞(图5B)。同时，BioPlanet途径证实了hMSC_BMP2 + IBMX + TGFβ组中活化的TGF-β调节细胞外基质。因此，作者判断BMP2和IBMX导致hMSCs分化为脂肪细胞，TGF-β抑制这一过程，并将这些细胞重定向分化为软骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞。TGF-β信号在OS发育过程中存在缺陷(图5C)，TGF-β信号异常表达，脂肪细胞无法分化为正常骨细胞。这阻碍了脂肪细胞的发育，导致了OS的脂肪细胞样亚型(图5D)。在临床翻译中，转移的患者更有可能有高风险评分(图5E)。作者应用Huvos分级系统来判断新辅助化疗对OS的有效性。然而，不同级别的脂肪细胞样亚型的风险评分没有差异，表明脂肪细胞样亚型对新辅助化疗具有耐药性(图5F)。
图5 TGF-β信号缺失导致发育过程中的脂肪细胞样呈OS亚型
6. 依托泊苷通过影响OS亚型和纠正异常通路发挥有效的缓解作用
与低风险评分的免疫原性亚型相比，OS患者存活时间更长，转移发生的可能性更小(图6A)。Huvos系统将免疫原性亚型与更高的分级和对新辅助化疗的敏感性联系起来(图6B)。作者将免疫原性亚型基因标记应用于药物矩阵数据集，硫鸟嘌呤和依托泊苷引起的转录变化丰富(图6C)。
广泛的文献综述表明，依托泊苷是复发性和转移性OS的可行挽救性治疗候选药物。对暴露于7种浓度依托泊苷的OS细胞进行高通量转录组筛选。热图显示，随着剂量的增加，具有免疫原性亚型特征的前10个基因逐渐增加(图6D)。脂肪细胞样亚型特征与依托泊苷处理的剂量依赖性谱呈负相关(图6E)。作者确定免疫原性和脂肪细胞样亚型特征之间的剂量依赖性趋势，分析结果相同(图6F)。作者发现了CHEK2和RB1，在细胞周期通路中发挥关键作用。TP53在OS中的突变率也为15.39%(图6G)，说明依托泊苷可以抑制细胞周期通路并激活P53信号通路(图6H和图6I)。免疫原性OS亚型起源于MSCs，因为它与抗原加工和呈递密切相关(图6J)。因此，依托泊苷有望纠正异常的细胞周期和P53信号通路。
图6依托泊苷可通过影响OS亚型和纠正异常通路发挥有效的缓解作用
文章小结
看完这篇文章思路有没有觉得单细胞测序还有很多“花样玩法”？这篇文章的内容真的是相当丰富，文章从综合单细胞分析入手，发现异常的细胞周期通路和IFITM5突变体是骨肉瘤的潜在致病因素，并且表明依托泊苷是一种很有前途的化疗药物。单细胞纯分析，不用做实验，直接拿下一区7分+的文章，效果不得不说很赞啊！你是不是也迫不及待准备大展身手啦？这么适合临床医生的生信思路，快来尝试一下吧！风里雨里小记者还在等你，需要思路设计、生信分析随时联系我哟~
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