小记者在生信圈探索多年，精通各种分析方法，积累了各种发文利器！听说最近有些小伙伴的科研不是很顺利，还在为文章而忧愁，小记者马上拿出发文利器！今天小记者推荐的是一篇关于成纤维细胞的生信文章，因其思路亮眼，逻辑清晰，就迫不及待来给小伙伴们分享来啦！
小记者细细阅读了这篇文章，发现其有以下几个优点：1. 本研究以成纤维细胞为主要研究对象，紧跟临床热点话题，妥妥滴吸人眼球！2. 本研究综合了单细胞测序和bulk测序数据，综合地分析了癌症相关成纤维细胞的浸润和串扰对肝内胆管癌的预后和微环境的影响，数据量大，研究的内容广，是文章质量的关键！3.本研究通过WCGNA+预后模型+单细胞测序+药物敏感性等分析，全面地分析了细胞间通讯和信号通路激活在微环境重塑和肝内胆管癌发展中的作用。让人感叹其思路新颖，内容充实！轻轻松松斩获7分+！你还在等什么呢？（ps：成纤维细胞一直以来都是生信领域的研究热点，结合单细胞测序数据和bulk测序数据进行分析，无疑是乘了飞行器，可以带领生信小白瞬间起飞！对成纤维细胞感兴趣的小伙伴可以来找小记者哦！这里有新鲜出炉的生信热点方向，还有一大波的可复现的创新思路呦~）
后台回复“999”获取原文献，文献编号240530
题目：Bulk和单细胞转录组学的综合分析揭示了癌症相关成纤维细胞的浸润和串扰是肝内胆管癌预后和微环境重塑的新预测因子
杂志：Journal of Translational Medicine
影响因子：IF=7.4
发表时间：2024年5月
研究背景
肝内胆管癌(ICC)是一种高度恶性肿瘤，以结缔组织增生基质为特征。越来越多的证据表明肿瘤微环境的异质性及其在促进肿瘤发生和耐药中的重要作用。并且有研究表示，单细胞转录组学可以揭示TME中不同细胞类型内复杂的细胞间通讯网络。然而，关于细胞间通讯和信号通路激活在微环境重塑和肿瘤发展中的综合影响的探索仍然有限。
数据来源
数据集/队列 |
数据库 |
数据类型 |
详细信息 |
TCGA-CHOL |
TCGA |
RNA-seq数据 |
51例肝内胆管癌样本 |
GSE89748 |
GEO |
RNA-seq数据 |
118例肝内胆管癌样本和2例正常样本 |
GSE107943 |
GEO |
RNA-seq数据 |
57例肝内胆管癌样本 |
GSE138709 |
GEO |
scRNA-seq数据 |
8例肝内胆管癌样本 |
研究思路
本研究首先进行了加权基因共表达网络分析(WGCNA)，并构建预后模型，来识别癌症相关成纤维细胞(CAFs)浸润生物标志物。并且利用肿瘤和邻近正常组织的单细胞转录组学分析细胞间通讯网络和重要的受体配体复合物。本研究利用' prophytic '包进行药物敏感性分析。此外，本研究使用“scMetabolism”软件包来比较不同细胞类型的代谢差异。
主要结果
1. 肿瘤相关成纤维细胞浸润相关基因组的WGCNA
为了探索免疫细胞在胆管癌中的比例及其在肿瘤发生和发展中的作用，本研究使用MCP-counter算法来估计TCGA-CHOL数据集中成纤维细胞的丰度。研究发现，与其他免疫细胞相比，成纤维细胞与临床不良结果的关联更为显著。此外，在TNM晚期患者中，CAFs的丰度显著增加(图1A)。本研究对TCGA数据库中的胆管癌样本进行加权基因共表达分析(WGCNA)，以鉴定与CAFs浸润相关的基因模块，其中涉及共表达网络的构建和共表达模块的鉴定(图1B)。采用Pearson检验评估CAF浸润评分与模块之间的相关性。值得注意的是，黑色和蓝绿色模块(共1111个基因)与临床适应症和CAFs浸润的相关性最强(图1C)。将这两个模块化基因集与TCGA差异表达基因相交，共获得784个与CAFs浸润相关的基因集(图1D和E)。KEGG通路分析显示，上述基因集也显著富集到信号转导和内分泌系统相关的通路中(图1F)。
图1 CAFs炎症相关基因的筛选
2. 基于CAFs的风险模型构建与验证
将包含生存时间和状态预测信息的TCGA-CHOL数据库作为训练集，利用从交叉过程中获得的基因构建基于CAFs的风险模型。首先，通过单因素Cox比例回归分析，鉴定出12个与生存显著相关的CAFs相关基因(图2A)。对这些基因进行LASSO分析以缩小范围(图2B和C)。随后，从LASSO分析中选择了9个基因，经过多因素Cox回归分析，只剩下5个基因(EVA1A、APBA2、LRRTM4、GOLGA8M、BPIFB2)(图2D)。利用多变量Cox分析得到的系数β和各基因表达量建立基于CAFs的风险模型:CAFs评分= (exp (EVA1A) * 0.447 - exp (APBA2) * -0.438 + exp (LRRTM4) *0.284 - exp (GOLGA8M) *1.183 + exp (BPIFB2) *0.870。根据中位截止值将训练集中的患者分为高(n = 18)和低(n = 18) CAFs评分组。值得注意的是，CAFs评分高的患者预后较差(图2E和G)。通过ROC曲线评估风险模型的预测性能，在1年、3年和5年的AUC值分别为0.938、0.932和0.943(图2F)。此外，CAFs评分较高的患者对吉西他滨、喜树碱、博莱霉素、阿霉素和栓塞素的敏感性增加(图2H、I、J、K、L、M、N和O)。
图2 训练和验证队列中CAFs相关风险模型识别和化学敏感性分析
在验证阶段，利用GSE8974和GSE107943验证基于CAFs的风险模型的预测效果。使用上述公式计算每个样本的风险评分，其截止值与训练队列的截止值一致。Kaplan-Meier分析和风险图一致表明，在两个GEO数据库中，与得分较低的患者相比，得分较高的患者的生存时间较短(图3A、B、C和D)。此外，ROC曲线证实了该模型在两个验证数据集上的可靠性能(图3E和F)。
图3风险特征验证
3. scRNA-seq数据处理和细胞类型标注
为了揭示肿瘤微环境的复杂细胞组成，本研究对来自5名患者的5个肿瘤样本和3个相邻的正常样本进行了注释。采用下降和无监督的细胞聚类，根据它们的表达谱识别细胞亚群。本研究鉴定出9个主要的细胞亚群:恶性细胞、肝细胞、胆管细胞、内皮细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和成纤维细胞(图4A-B)。每个细胞亚群中的差异表达基因如图4C所示。此外，这些主要细胞类型的浸润比例因组织类型和样本来源而异，可能表明ICC进展阶段的差异(图4D, E和F)。
图4 邻近正常和肿瘤组织的单细胞图谱
4. CHOL细胞亚群的特征分析
为了研究不同细胞亚群之间的通路异质性，本研究利用特征基因组进行了KEGG分析。根据富集结果得出，这些途径大致分为五组，主要强调代谢相关途径(图5A)。此外，巨噬细胞中富集的铁下垂、细胞凋亡和坏死下垂等细胞过程相关通路，恶性细胞中富集的p53信号通路，T细胞中富集的细胞衰老等细胞过程相关通路可能参与了肿瘤细胞的增殖和死亡过程(图5B)。接下来，研究肿瘤和邻近正常组织之间的代谢差异。引人注目的是，本研究观察到相反的趋势，肿瘤亚组在大多数代谢途径中表现出富集。这种富集在调节糖酵解/糖异生、氧化磷酸化、柠檬酸循环以及与细胞色素P450相关的丙酮酸、谷胱甘肽和药物代谢的途径中尤为显著(图5C)。在单个细胞亚群水平上进一步检查，上述显著差异可能与肿瘤样本中的肝细胞有关(图5D)。
图5 样本类型和细胞亚群的通路分析
5. 分析肿瘤与邻近正常组织细胞间通讯的差异
本研究使用CellChat的分泌信号和ECM受体数据库来分析单细胞数据集中的细胞相互作用。首先，构建了一个描述肿瘤和正常样本之间信号通路变化的通信网络(图6A和B)。并且图6C分析了肿瘤和正常样本之间所有细胞群之间通信数量的变化，肿瘤组成纤维细胞向恶性细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管细胞和T/B细胞信号通路的数量和强度均明显高于正常组。然而，从抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)到T细胞的细胞通讯明显减少(图6D和E)。此外，热图还显示成纤维细胞对两个样本的总体信息流贡献最大(图6F)。随后，本研究发现，成纤维细胞是主要的信号发送者，而巨噬细胞和恶性细胞分别代表正常和肿瘤样本中的主要受体(图6G)。
图6 肿瘤样本与邻近正常组织细胞相互作用的比较
在正常样本中，多种途径，如与CCL、TNF和MIF相关的途径，通过配体受体对的介导参与细胞间信号转导。相反，在肿瘤样本中，细胞间相互作用主要活跃于胶原、WNT、CXCL、TGFb和EGF信号通路(图7A)。本研究进一步评估了两组成纤维细胞与其他细胞类型之间配体受体通信的频率。这些发现成纤维细胞在协调ICC细胞间通信中起关键作用，揭示了不同组织和细胞类型之间的不同通信模式。此外，特异于FGF信号，主要是配体-受体对FGF1-FGFR2介导成纤维细胞与胆管细胞、内皮细胞和恶性细胞之间的细胞间通讯(图7B)。在肿瘤样本中，胶原通路介导的成纤维细胞与其他细胞之间的信号转导被明显放大(图7C)。类似的现象也发生在FGF信号通路中(图7D)。
图7 肿瘤样本与邻近正常组织细胞相互作用的比较
6. 不同成纤维细胞亚群的功能分析
本研究发现在肿瘤组织中观察到成纤维细胞与恶性细胞之间的相互作用动态显著增加。为了详细描述其固有特征，利用SNN算法结合t-SNE分析将这些成纤维细胞复杂地分为六个亚簇(图8A和B)。值得注意的是，eCAFs仅在肿瘤样本中检测到。在每个样本中，除eCAFs外的其他CAFs亚群分布在肿瘤和邻近的正常组织中，但每种主要细胞类型的浸润程度不同(图8C)，这可能反映了ICC进展阶段的差异。本研究描绘了每个成纤维细胞亚组的前5个独特基因特征(图8D)。此外，对CAFs亚组的KEGG分析显示，肿瘤特异性eCAFs主要富集于脂肪酸和甘油三酯代谢过程中。CellChat分析发现肿瘤样本中特异性激活的WNT信号通路可能受ICAFs和mCAFs调节(图8E)。与正常样本相比，CAFs亚型之间的相互作用更加强烈，并且仅在肿瘤中观察到涉及iCAFs的信号通信。此外，肿瘤样本中的apCAF、eCAFs和mCAFs之间传递了更多的信息(图8F)。
图8 正常和肿瘤组织中成纤维细胞亚群的特征
7. 成纤维细胞浸润相关基因的转录因子分析
本研究进一步在单细胞数据集中探索针对CAF浸润相关基因的特异性转录因子。生成热图以说明每个细胞子集的调节网络的变化。在所有细胞中，ZNF813、PRDM6和EN1表现出最高的调控活性(图9A)。此外，HOXA5、WT1和LHX2被鉴定为成纤维细胞特异性基因(图9B)。图9C显示了转录因子的空间分布特征。对HOXA5、WT1和LHX2的靶向调控基因进行KEGG富集分析发现，上述三种特异性TFs及其调控靶点在一些经典的肿瘤相关通路如MAPK、WNT、NF-kappa B信号通路中富集(图9E)。此外，GO富集分析强调了这些基因参与了含有胶原的细胞外基质的形成(图9F)。
图9 成纤维细胞浸润相关基因的转录因子分析
文章小结
本研究揭示了成纤维细胞-肿瘤细胞相互作用在肝内胆管癌免疫抑制微环境重塑中的关键作用，为肝内胆管癌的治疗提供进一步的见解。看完这篇文章，有没有被这篇文章的创新思路所惊艳？本研究首先以成纤维细胞为主要研究对象，紧贴临床，非常容易吸引审稿人的眼球。并且，本研究通过WCGNA+预后模型+单细胞测序+药物敏感性等分析，综合分析了细胞间通讯和信号通路激活在微环境重塑和肝内胆管癌发展中的作用。所以本研究轻松拿下了7分+的高分，效果不得不说很赞啊！想在成纤维细胞方向做点新东西的小伙伴，不要错过这个好思路，可以换个疾病复现，还可以拓展做国自然课题，一举两得，有需要的小伙伴可以来找小记者做设计哟~
小记者话生信
如果您的时间和精力有限或者缺乏相关经验，并且对生信分析和期刊推荐有所需要的话，“生信日报”非常乐意为您提供如下服务：免费思路评估、付费生信分析和方案设计以及付费选刊等，有意向的小伙伴欢迎咨询小记者哦！
生信分析
思路设计
服务器租赁
扫码咨询小记者
1、超高分sci！将近50分你还有不看的理由？德国学者真是把机器学习玩出花了，直接构建一个新生信分析方法，还不快看！
2、国自然出品就是牛！复旦大学施思&虞先濬团队：借公共数据库+RNA-seq+湿实验研究癌症成纤维，IF近9分属实佩服！
3、MDPI期刊再爆丑闻！23本期刊存在“审稿人工厂”问题！
END