电量不足1%也要学习的套路！中南大学湘雅医院王东生团队：网络药理学+ miRNA微阵列，轻松带你破除中医药的“圈”！- 大数跨境

电量不足1%也要学习的套路！中南大学湘雅医院王东生团队：网络药理学+ miRNA微阵列，轻松带你破除中医药的“圈”！

生信日报

2024-05-04

近年来，中医药在新冠肺炎抗疫中发挥了重要作用，它巨大的贡献也提醒着我们，中医药值得进行更深入的研究。并且，中医药在国自然中占比很高，是国家重点扶持的科研方向。然而，作为一个中药出身的生信人，小记者深知传统中医药的研究困境，但这能难倒充满科研灵感和创新思路的小记者吗？“万能”小记者马上给小伙伴们提出了解决办法！那就是抱上生信的大腿，有了生信助推器，再加上国家科研政策的倾斜，中医药将再次起飞！而且，关于中医药的生信文章的发文量呈逐年递增趋势，这正是一个好兆头！所以小记者迫不及待给小伙伴们来推荐文章来啦！

今天小记者就为大家带来了一篇超容易复现的网络药理学文章。该文章结合了网络药理学和miRNA微阵列分析大黄蟅虫丸（DHZCP）在血栓治疗中的作用，内容完整，研究思路明确。首先，采用网药分析三部曲（药物-疾病靶点分析、PPI网络、GO/KEGG通路分析）引出主体研究内容，而且通过微阵列分析获得DHZCP治疗凝血酶刺激的MEG-01细胞的miRNA谱，并预测靶基因。最后利用PCR实验验证了所选的miRNA和mRNA，充分展现了生物信息学作为工具所发挥的作用。什么是中医药的范文，这篇妥妥的就是！生信小白也可轻松上手哦~ 中医药领域的小伙伴们赶快行动起来吧，换上自己研究的中药与疾病，马上起飞！（ps：“网络药理学”在中医药研究领域的应用已经十分常见，想要复现思路的小伙伴，欢迎找小记者定制分析哟~）

题目：结合网络药理学和microRNA微阵列分析，鉴定miRNA在大黄蟅虫丸治疗血栓形成中的作用
杂志：Computers in Biology and Medicine
影响因子：IF=7.7
发表时间：2024年3月
后台回复“999”获取原文献，文献编号240504

研究背景

血栓性疾病是世界范围内导致死亡的主要原因，迫切需要改进治疗策略。大黄蟅虫丸 (DHZCP)是一种广泛用于治疗血栓性疾病的中药，然而，其潜在的机制仍不清楚。本研究旨在从生物信息学和miRNA方面探讨DHZCP治疗血栓形成的潜在机制。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	详细信息
大黄、桃仁、黄芩、乳香、杏仁、地黄、甘草的化合物和靶点数据	TCMSP	大黄、桃仁、黄芩、乳香、杏仁、地黄、甘草的化合物和靶点数据	大黄、桃仁、黄芩、乳香、杏仁、地黄、甘草的化合物和靶点数据
化合物的SMILES数据	PubChem	化合物的SMILES数据	化合物的SMILES数据
血栓靶点数据	OMIM	血栓靶点数据	血栓靶点数据
血栓靶点数据	DisGeNET	血栓靶点数据	血栓靶点数据
血栓靶点数据	DrugBank	血栓靶点数据	血栓靶点数据
血栓靶点数据	GeneCards	血栓靶点数据	血栓靶点数据
血栓靶点数据	TTD	血栓靶点数据	血栓靶点数据

研究思路

本研究利用网络药理学探索DHZCP治疗血栓形成的靶点，并通过微阵列分析获得DHZCP治疗凝血酶刺激的MEG-01细胞的miRNA谱，并预测靶基因。基于靶点的重叠，本研究进行了成分-靶点-miRNA网络分析和富集分析，并使用PCR实验验证了所选的miRNA和mRNA。

主要结果

1. DHZCP有效成分及靶标的鉴定

利用公共数据库和文献资料，获得了DHZCP的成分和潜在靶点。基于OB和DL，从中药复方中鉴定出155个有效成分和147个靶点。此外，从文献和Swiss Target Prediction中选择80个活性成分和786个靶点。经过数据组合和重复剔除，共鉴定出230个组分和850个潜在基因，Cytoscape可视化的药物-成分-目标网络图由1089个节点和5990条边组成(图1a)，网络中排名前10位的成分按度值如表1所示。为了更好地了解DHZCP可能的临床应用，本研究使用R工具对DHZCP进行了疾病分析，确定了908种与DHZCP相关的疾病。图1b显示了前20位疾病，包括缺血、心肌梗死、动脉硬化、肾衰竭、动脉硬化性心血管疾病、动脉粥样硬化、脑血管疾病和肝炎，与DHZCP的实际应用相一致。

表1 利用药物组分-靶点网络鉴定出DHZCP的前10个组分

图1 DHZCP的成分、靶点和治疗适应症

2. DHZCP治疗血栓形成的相关靶点的GO、KEGG富集分析

本研究使用venn图将DHZCP化合物的靶点与血栓靶点相交。交叉结果确定了235个共同基因(图2a)，用于进行GO和KEGG分析，结果如图2b所示。BP包括凝血和止血，与血栓形成有关。CC主要在膜筏、局灶黏附和质膜外侧受到影响，最富集的MFs是内肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白酶结合。接下来，本研究进行KEGG通路富集分析，对174条通路中的235个基因进行了评估，根据q值，前20条通路如图2d和2e所示。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、血小板活化、TNF信号通路等受影响最为显著，其相互关系如图2c所示。

图2 富集的GO和KEGG通路对DHZCP和血栓形成的潜在靶点分析

3. 药物-靶标-通路-疾病网络的构建

为了更好地了解DHZCP干预血栓形成的机制，本研究选择了q值最小的前20个通路，并从235个常见靶点中过滤出涉及上述通路的133个靶点。此外，本研究从CTD中获得了这133个靶点与“血栓形成”疾病后代之间的联系。利用这些关于通路、靶点和疾病的信息，使用CytoScape构建了一个药物-靶点-通路-疾病网络图(图3)，得到166个节点和2926条边。按程度排序，前10位基因分别为:PI3K-Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化、人巨细胞病毒感染、肿瘤蛋白聚糖、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎、流体剪切应力与动脉粥样硬化、弓形虫病、血小板活化(表2);前10位基因分别为:PTGS2、ESR1、NOS2、PTGS1、ESR2、F2、KDR、PIK3CG、MAPK1、EGFR(表3)。

图3 Hub基因的识别

表2 DHZCP治疗血栓形成的药物-靶标-通路-疾病网络中涉及的前10个通路

表3 DHZCP治疗血栓形成的药物-靶标-通路-疾病网络前10位靶点

4. DHZCP与血栓形成之间共同靶点的PPI网络

为了进一步探索血栓治疗潜在靶点与DHZCP的相互作用并鉴定核心基因，本研究将235个常见基因导入STRING，得到了包含185个节点和1394条边的PPI网络，中位DC为10。本研究将DC≥20确定为第一筛选条件，并获得了一个相对中心的PPI，包括50个节点和296个边，中位DC、CC和BC值分别为10、0.503和0.012。然后，将这些值作为附加标准，得到了一个包含20个基因和102条边的核心网络(图4a)，并构建了一个核心基因集中定位的PPI网络图(图4b)。使用CytoHubba选择偏心度法排名前20位的轮毂基因(图4c)。使用MCODE应用程序进行聚类分析，生成一个高度连接的子网，并将目标分为5个聚类(图4d)。这些结果表明，DHZCP的抗血栓作用可能通过AKT1、PI3KCA、MAPK1和BCL2L1发挥作用。

图4 DHZCP与血栓形成共同靶点的PPI网络

5. DHZCP可降低MEG-01细胞的活化状态

本研究选取MEG-01作为研究血小板生成过程和蛋白质生物合成机制的有用替代模型。通过观察凝血酶和DHZCP对MEG-01细胞的形态学变化和分化簇(CD)表达水平的影响，探讨DHZCP对血小板活化的作用，验证模型的有效性。如图5a所示，凝血酶刺激后，MEG-01细胞形态由规则的圆形变为不规则的假足形状，细胞周围产生更多类似活化站的血小板样颗粒，DHZCP处理减轻了这种影响。CD61和CD62P在MEG-01细胞中的表达证实了观察到的形态学变化。凝血酶或其他物质激活后，CD61的表达水平升高。同样，表达CD62P的细胞比例也呈现出与CD61表达平行的趋势，在凝血酶刺激下从2.33%上升到3.83%，然后在DHZCP处理下下降到3.38%(图5b和5c)。提示DHZCP具有活化血小板、活血化瘀的作用。

图5 DHZCP可降低MEG-01细胞的活化状态

6. 凝血酶和含DHZCP的大鼠血清处理MEG-01细胞的miRNA表达谱

考虑到DHZCP的抗血栓作用及其对血小板活化的抑制作用，本研究进一步通过miRNA表达谱探索其潜在的作用机制和作用位点。MEG-01细胞用凝血酶孵育模拟血小板活化，然后用含DHZCP的大鼠血清处理。miRNA芯片检测根据P<0.05和- FC ≥ 1.2的标准，在凝血酶刺激样本(M)中，相对于阴性对照组(N)，观察到75个miRNA上调，18个miRNA下调(图6a和6b)，在DHZCP和凝血酶处理组(D)中，相对于凝血酶孵育组(M)，观察到23个miRNA上调，100个miRNA下调(图6d和6e)。为了总结上述数据，本研究将M-N组中上调的miRNA与D-M组中下调的miRNA相交(图6c)，将M-N组中下调的miRNA与D-M组中上调的miRNA相交(图6f)。miRNA在血小板活化过程中发生变化，DHZCP治疗可逆转这一变化。最后，miRNA芯片分析鉴定出32个显著表达的miRNA，其中29个被凝血酶上调而被DHZCP下调，3个被凝血酶下调而被DHZCP上调(表4)。

图6 凝血酶和DHZCP刺激下MEG-01细胞的miRNA表达谱

表4 凝血酶和DHZCP处理后表达显著的miRNAs

7. GO和KEGG分析揭示了相关基因的潜在功能

为了确定筛选的miRNA的生物学功能，本研究预测了它们的靶基因并进行了富集分析。首先，从miRDB中筛选5589个靶点，从TargetScan中筛选6892个靶点，两组的重叠导致1846个共享基因(图7a)。miRNA-基因网络显示了miRNA与基因之间的关系(图7b)。然后，本研究使用p<0.05和q<1作为阈值进行GO和KEGG分析。关于BP, miRNA的靶基因主要参与突触组织和化学突触传递的调节。CC主要影响蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶复合物和外膜，MF主要与DNA结合转录激活因子活性、环孢素A结合、MAP激酶酪氨酸磷酸酶活性等相关(图7c)。KEGG通路共鉴定出46条通路，主要包括调控干细胞多能性和细胞粘附分子的信号通路(图7d)，这些通路可能参与DHZCP抗血小板活化的调控过程。

图7 与凝血酶和DHZCP治疗相关的不同表达miRNA靶基因的潜在功能

8. 网络药理学与微阵列结果的联合分析

基于之前的结果，本研究通过药理学网络分析获得235个靶点和1846个差异表达miRNA靶点。然后，本研究使用venn图将两组目标相交，并确定了23个共同目标(图8a)。基于p<0.05和q<1，利用GO和KEGG富集分析揭示靶标的潜在功能。本研究获得了1057个BP项目、23个CC项目和102个MF项目，每个方面的前10个项目如图8c所示。图8g显示了前20条通路，包括PI3K-Akt、凋亡和HIF-1信号通路等。图8e显示了通路与靶点和通路(图8f)之间的相互作用。为了进一步探索核心目标，本研究使用STRING和CytoScape构建了PPI网络，得到21个节点和44条边(图8d)。本研究将PPI网络中的7个靶点与药物组分-靶点- miRNA网络中程度较高的10个靶点相交(图8b)，确定了3个核心靶点，包括HIF1A、PIK3CA和MAPK1。

图8 网络药理学与微阵列分析结果的联合分析

9. miRNA和mRNA的qRT-PCR验证

为了验证miRNA和mRNA的确切变化，进行了qRT-PCR分析。考虑到miRNA微阵列中miRNA的FC和p-value，以及它们与文献中血栓形成和血小板活性的相关性，最后结合药理学和微阵列的结果分析，本研究选择了12个miRNA。根据联合分析和文献的核心靶点，本研究选择了四个mRNA。hsa-miR-935、hsa-miR-6720-5p、hsa-miR-4674、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-6825-3p和has-miR-4639-5p等7种miRNA的变异趋势与芯片结果相同(图9a-g)。研究结果发现，只有一个mRNA BCL2L1(图9h)表现出与上述miRNA相似的变化趋势。这些结果支持了BCL2L1可能作为DHZCP抗血小板活化的潜在治疗靶点的观点，其中miRNA可能作为调节因子。

图9 miRNA和mRNA的qRT-PCR结果

文章小结

本研究通过网络药理学和芯片分析探索了DHZCP的抗血栓作用和潜在的调控靶点，为DHZCP抗血栓和抗血小板作用提供了可能的潜在机制。看完这篇文章，有没有觉得7分+的文章非常简单？此研究将中药治疗作用和网络药理学机制分析进行了完美地有机结合，分析并不复杂，PCR实验难度也不高，但结合的效果很不错，效果非常Nice！趁着国家扶持的大好时机，中医药方向的小伙伴要赶紧抓住机会，利用生信助攻中医药，缩短研究周期，尽早发文，同时这个思路还可以拓展成为国自然课题，一举两得！想复现思路的朋友快快联系小记者吧！