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1.本研究利用单细胞测序+空间转录组学技术，从不同维度分析与胃癌抗PD-1耐药有关的免疫检查点的相互排他性和共存模式，多维度且大量数据的使用，提高了文章的质量，加大了文章的新颖性。
2.本研究利用多元线性回归相互作用模型+Nichenet+转录因子分析和CellOracle分析等，深入研究免疫治疗机制，扩大了文章的深度！文章分析思路清晰，手法老练！堪称单细胞测序+空间转录组分析的范文！文章轻松拿到6分+！（ps：听完小记者的介绍，小伙伴们是不是瞬间信心倍增？单细胞测序+空间转录组学就是杠杠滴厉害! 如果你有思路，不知怎么复现，赶紧关注小记者吧! 小记者这里有超多高分思路与新的分析方向，快来和小记者一起学习吧! 下一个拿高分的就是你!）
题目：免疫检查点的相互排他性和共存模式表明NKG2A与胃癌的抗PD-1耐药有关
杂志：Journal of Translational Medicine
影响因子：IF=6.1
发表时间：2024年8月
公众号回复“999”领取原文PDF，文献编号：240815
研究背景
越来越多的临床研究开始探索与免疫检查点抑制剂的联合策略，旨在为克服胃癌抗pd -1治疗耐药提供新的机会。不幸的是，某些免疫检查点抑制剂联合策略的探索已经产生了次优结果。因此，有必要综合分析免疫检查点的表达模式，并确定抗pd -1抑制剂与其他免疫检查点抑制剂的最佳联合方案。
研究思路
利用单细胞RNA测序和多元线性回归相互作用模型，本研究分析了胃癌中CD8+ T细胞的免疫检查点表达特征以及介导抗pd -1治疗耐药性的免疫检查点表达模式(ICEP)。此外，本研究利用转录因子分析和CellOracle来探索CD8+ T细胞分化命运的转录调控机制。最后，本研究利用Nichenet和空间转录组分析来研究免疫检查点的空间表达模式。
主要结果
1.胃癌CD8+ T细胞免疫检查点相互作用分析
CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫应答中起着至关重要的作用，本研究提取了40381个 CD8 + T细胞亚群,进一步划分成7个CD8 + T细胞的子组,包括CD8 +幼稚T细胞, CD8 + IL7R +记忆T细胞, CD8 + KLRC1 +组织常驻记忆T细胞, CD8 + GMZK +效应T细胞， CD8+ GMZH+效应T细胞， CD8+耗竭T细胞，增殖CD8+ T细胞 (图1A, B)。此外，本研究计算免疫检查点分子在T细胞中的表达比例，发现CTLA4在CD4+ T细胞上的表达比例更高(图1C)。为了探究免疫检查点在CD8+ T细胞中的表达，本研究基于7个免疫检查点在CD8+ T细胞中的表达值进行k-means聚类，得到免疫检查点共表达的50个亚群，提示CD8+ T细胞中存在共表达现象(图1D)。本研究通过计算相互作用测试T值来量化CD8+ T细胞增殖功能与两个免疫检查点表达的关系。如果T值为负，则说明两个免疫检查点的共表达水平对CD8+ T细胞的增殖功能有协同抑制作用(图1E)。结果显示，只有KLRC1与PDCD1、VSIR与KLRC1的t值为负，而PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3、CD38之间的t值均为正(图1F、G)。
图1 胃癌CD8+ T细胞免疫检查点相互作用分析
2.共表达分析显示免疫检查点的互斥性和共存模式
本研究从17例胃癌患者中获得新鲜肿瘤组织scRNA-seq 数据(图2A)，研究PD-1和NKG2A是否在细胞亚群水平上共同表达或表现出不同的表达模式。研究发现PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3和CD38与三个免疫检查点共表达的比例一定，PDCD1、CTLA4、TIGIT和LAG3甚至与四个免疫检查点共表达 (图2B-C)。为了进一步了解ICEP所代表的CD8 + T细胞的状态,本研究将CD8 + T细胞分成6组,包括CD8 +幼稚T细胞, CD8 + IL7R +记忆T细胞, CD8 + KLRC1 + 组织常驻记忆T细胞, CD8 + GMZK +效应T细胞,CD8 + GMZH +效应T细胞,和CD8+ 耗竭T细胞 (图2 D)。通过量化每个ICEP亚组的偏好，研究发现共表达PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3和CD38的亚组主要富集CD8+ Tex，其次是CD8+ GMZK+ Teff和CD8+ GMZH+ Teff (图2E)。
图2 胃癌免疫检查点的互斥和共现模式
3. 免疫检查点共表达模式与CD8+ T细胞的不同分化命运相关
本研究利用Monocle3推测了CD8+ T细胞的潜在分化轨迹。结果表明，CD8+ Tn细胞处于CD8+ T细胞分化轨迹的起点，随后分化为两条路径。分支1从CD8+ Tn发展到CD8+ GMZK+ Teff、CD8+ GMZH+ Teff，最后发展到CD8+ Tex。分支2遵循从CD8+ Tn到CD8+ IL7R+ Tm, CD8+ KLRC1+ Trm，最终到CD8+ Tex的路径(图3A, B)。此外，本研究发现PDCD1, CTLA4和TIGIT的表达在CD8+ Tn向CD8+ KLRC1+ Trm分化的过程中最初下降，但在向CD8+ Tex分化的过程中达到峰值 (图3C)。为了描述这两种ICEP在CD8+ T细胞中的上游调控机制，本研究使用R包SCENIC分析了不同CD8+ T细胞亚群中的转录调控因子。结果显示，CD8+ Tex细胞高度富集与T细胞分化相关的转录因子，如RORC、NR1D1、PPARG、MSC等(图3D)。进一步结果显示RUNX3与KLRC1表达呈正相关，且RUNX3在无应答组中表达相对较高(图3E)。本研究根据CellOracle预测的矢量场流结果，发现MSC敲除导致1支上CD8+ T细胞的矢量方向发生变化，大多数矢量指向2支上的CD8+ T细胞，提示ICEP1 CD8+ T细胞的分化可能在MSC敲除后受到限制 (图3F)。
图 3 胃癌CD8+ T细胞分化的命运决定及转录调控机制
4.NKG2A互排他性与胃癌抗PD - 1耐药有关
为了研究ICEP是否介导了胃癌对抗pd -1治疗的耐药，本研究评估了无反应组和反应组之间不同ICEP比例的差异。结果显示，排序差异最高的ICEP是单独高表达KLRC1的CD8+ T细胞 (图4A)。随后，比较了抗pd -1治疗前后以及不同治疗结果中7个免疫检查点及共抑制分子PDCD1、CTLA4、LAG3、TIGIT、KLRC1、VSIR和CD38的表达差异，值得注意的是，在两个时间点，无应答组的T细胞中KLRC1表达均显著升高，并且在CD8+ T细胞中也观察到了这种模式(图4B)。为了阐明ICEP2 CD8+ T细胞如何介导胃癌对抗PD-1治疗的耐药性，本研究对一名PD患者接受抗PD-1治疗后的胃癌组织进行了空间转录组学研究，鉴定出14个细胞亚群(图4C)。本研究根据肿瘤细胞的空间富集程度，将亚组1、8、4、9、11、5、2和13标注为肿瘤区域，而将亚组0、3、6、7、10和12标注为肿瘤周围区域(图4D, E)。结果显示，PDCD1和TIGIT的表达在肿瘤内和肿瘤周围区域之间没有显著差异。值得注意的是，CTLA4在肿瘤内的表达高于肿瘤周围 (图4G)。此外，研究发现KLRC1在肿瘤区域的表达更高(图4F)。本研究根据标记基因提取CD8+ T细胞亚组，并根据肿瘤细胞浸润程度将其进一步分为高密度、中密度、低密度和肿瘤周围区域(图4G, H)。然而，肿瘤周围区域的细胞毒性评分低于低密度肿瘤区域(图4I)。
图4 CD8+ T细胞互排模式与胃癌抗pd -1耐药有关
5.ICEP2 CD8+ T细胞的免疫浸润与LGMN+巨噬细胞有关
为了确定不同细胞类型之间的关系，本研究对13种细胞类型的浸润水平进行Pearson相关分，结果观察到髓系细胞在TME中的浸润与CD8+ KLRC1+ Trm细胞的浸润表现出最强的正相关性(图5A)。本研究进一步提取骨髓细胞，并通过重新聚类和注释将其重新分类为8个亚型，包括两个单核细胞簇，三个肿瘤相关巨噬细胞(TAM)簇和三个树突状细胞(DC)簇(图5B)。此外，在已鉴定的DC亚型中，高表达CLEC9A的CDC1细胞在Pre-NR后组中高度富集，而在Pre-R和Pre-NR组中所占比例相对较低 (图5C)。本研究对巨噬细胞亚群的功能谱进行评分，结果显示IL1B+巨噬细胞表现出最强的促血管生成能力(图5D)。随后，本研究对TCGA-STAD中估计的细胞亚组浸润水平进行Pearson相关分析。结果显示，ICEP2 CD8+ T细胞核心亚群CD8+ KLRC1+ Trm的浸润与LGMN+巨噬细胞的浸润呈显著正相关，而ICEP1 CD8+ T细胞核心亚群CD8+ Tex的浸润与LGMN+巨噬细胞的浸润无相关性(图5E)。此外，研究发现LGMN+巨噬细胞的免疫浸润与TCGA-STAD患者预后不良相关(图5F)，而CD8+ KLRC1+ Trm细胞的免疫浸润与预后良好相关。
图5 ICEP2 CD8 + T细胞浸润与LGMN+巨噬细胞浸润的相关性
6.ICEP2 CD8 +T细胞可能通过CXCL16 - CXCR6被LGMN+巨噬细胞募集
为了进一步阐明LGMN+巨噬细胞和CD8+ KLRC1+ Trm细胞相关免疫浸润背后的原因，本研究使用NicheNet在scRNA-seq数据中推断了这些亚群之间的通信网络。结果发现，在抗pd -1治疗无应答的患者中，LGMN+巨噬细胞通过增强的CXCL16- CXCR6信号通路招募ICEP2 CD8+ T细胞(图6A)。同时，本研究观察到LGMN+巨噬细胞在亚组1中富集，其在空间上接近高度浸润的ICEP2 CD8+ T细胞亚组9(图6B)。使用Cellchat的进一步分析显示，作为信号发送者的亚群1和亚群9之间通过CXCL信号通路进行细胞间通信(图6C)。此外，TCGA-STAD队列的相关分析显示LGMN与CXCL16表达显著正相关(图6D)。在TCGA-STAD队列中进行相关分析，发现RUNX3与CXCR6表达显著正相关(图6E)。
图6 LGMN+巨噬细胞通过CXCL16-CXCR6募集ICEP2 CD8+ T细胞
文章小结
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