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付费生信分析
小记者发现生信圈也是越来越卷了呢！
单个热点方向预后分析，编辑和审稿人早已司空见惯，已经没有什么创新性了。
两个热点强强联合的预后分析越来越多，比如说m6A关联铁死亡等，且发的文章影响因子普遍>5，小记者认为多热点方向研究比单一方向预后更能得到审稿人的青睐。
（ps：如果不知道选哪两种热点结合，可以随时来找小记者设计哦！）但是也不是随便两个热点就能结合分析，它们之间还是要有一定关联的，比如今天小记者要推荐的这篇文章“血管生成”和“肿瘤微环境”的双热点纯生信文章，两大热点强强联合，分析思路创新，暗藏乾坤！
杂志：npj Precision Oncology
影响因子：IF=7.9
骨肉瘤（OS）是一种主要发生在儿童和青少年的高死亡率的恶性肿瘤。由于骨肉瘤的异质性和复杂的肿瘤微环境（TME），传统的治疗方法容易产生耐药性，术后复发和转移是OS预后不良的主要原因，迫切需要一种新型生物标志物来对OS患者制定个体化治疗方案。血管生成在肿瘤进展中起着至关重要的作用，具有很高的预测价值和免疫治疗的潜力。
数据来源
从公共数据库获取OS病人相关的RNA-seq 数据集（TARGET-OS、GSE21257）、单细胞 RNA-seq 数据集（GSE152048）和免疫治疗相关数据集（GSE91061、GSE173839）。
通过共识聚类算法识别不同的血管生成相关模式并用R包分析集群之间的预后差异。随后进行GSVA富集分析，利用ssGSEA法计算特异性活性的免疫评分和肿瘤微环境中免疫细胞浸润评分。
识别三种血管生成模式的每两个簇之间相互作用的差异表达基因（DEGs），然后对 DEGs的表达量和总生存率进行单变量Cox回归分析，将错误发现率（FDR）小于0.05的基因鉴定为血管生成相关基因。通过主成分分析（PCA）和ANGscore分数来构建预测患者血管生成模式和预后的定量评分。
最后利用OncoPredict来分析癌症患者对候选药物的敏感性和耐药性。
OS中血管生成相关模式的鉴定和GSEA分析
基于对36个血管生成基因表达的共识聚类，鉴定出了三种不同的血管生成模式，即聚类1、聚类2和聚类3（图1a）。利用PCA分析将聚类进行划分（图1b）。
生存曲线图2c，d显示，聚类2的总生存期和无复发生存期均有显著改善，三个聚类中血管生成基因的表达总体上存在显著性差异（图1e）。
图1 TARGET-OS队列中的血管生成模式
为了探索三种不同血管生成模式之间的生物学功能，作者利用MSigDB标志基因集进行了GSVA分析。结果表明，聚类2在免疫浸润相关功能中富集，包括异体移植排斥、炎症反应、IL2/STAT5信号通路和IL6/JAK/STAT3信号通路（图2a，b）。
此外，生物氧化过程如氧化磷酸化、活性氧途径和脂肪酸代谢也被富集，说明聚类2中患者可能处于复合免疫状态。此外，聚类1和聚类3与免疫抑制相关（图2a-c）。
随后，利用ssGSEA算法发现聚类2中OS患者在CD8+T细胞效应因子、抗原加工机制和免疫检查点方面有较高的富集（图2d）。
图2 TARGET-OS队列中血管生成模式的生物学特征
利用limma的t检验法来分析log（TPM + 1）表达数据，鉴别出三种血管生成相关模式之间的DEGs，图3a表明聚类2是免疫激活的微环境。随后通过计算癌症免疫周期来量化每个步骤的激活程度，全面阐明了不同人群的癌症免疫特征。
聚类3的整体活性在步骤2、4、5中显著下调，这可能是导致其免疫抑制表型的原因之一（图3b）。使用ssGSEA对TME中28个免疫细胞的浸润情况进行分析。
活化的CD8+T细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞在聚类2中含量高，证实了其增强的抗肿瘤状态。与聚类3相比，聚类1的自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞水平较低（图3c）。
图4d是免疫检查点的表达，聚类2中PD-L1、PD-L2、CTLA4、LAG3、TIM-3、IDO1和TIGIT的总体表达量较高（图4d）。以上结果表明聚类2是免疫炎症表型。
图3 TARGET-OS队列中三种血管生成模式的TME和免疫特征
根据血管生成相关基因模式分OS亚型
差异分析鉴定出66个常见的DEGs（图3e），单变量Cox回归分析表明32个候选基因具有显著的预后价值。基于32个候选基因，采用共识聚类的方法将TARGET-OS数据库中的OS患者划分为4个亚型，即血管生成相关基因聚类1-4（图4a）。
血管生成相关的聚类1和聚类4的总生存期和无复发生存期优于其他两组，并且癌症免疫周期被激活，CD8+ T细胞、巨噬细胞、NK细胞和B细胞募集（图4d），此外TIMP1、COL5A2的表达与其他组有显著差异（图4e）。
与血管生成聚类2相一致，血管生成相关的聚类1和聚类4在CD8+ T效应因子和免疫检查点方面具有更高的富集分数（图4f）。这些结果表明，聚类1和聚类4与TME中的免疫激活相关。
图4 基于TARGET-OS队列血管生成特征的OS集群分类
利用scRNA-seq数据来鉴别TME中有助于血管生成模式的调节因子。为了构建定量评分来预测患者血管生成模式和预后价值，提取血管生成相关基因进行主成分分析(PCA)，然后构建了一种ANGscore算法来量化血管生成的状态：
其中expi表示血管生成相关基因的表达水平，PC1和PC2是前两个主要基因PCA生成的成分。成骨细胞是临床中主要的恶性OS细胞之一，其ANGscore评分较高（图5），高ANGscore的OS患者预后较差，伴有免疫荒漠表型。
图6中scRNA-seq数据中的伪时间和细胞通讯分析显示，随着ANGscore升高，细胞恶性程度增加。IFN-γ信号参与肿瘤进展和肿瘤免疫微环境的调节。此外，也证明了ANGscore评分是有一定科学依据的，与免疫细胞浸润和免疫治疗应答率有关。
图5 TARGET-OS队列中的ANGscore的量化分析
图6 OS患者的scRNA-seq数据中，高ANGscore表明恶性表型升高
ANGscore预测预后和临床免疫反应
为了验证ANGscore的有效性，计算了外部验证集GSE21257中具有完整临床数据的每个样本的得分。图7表示，与高分组相比，低评分组的预后有了明显改善，高分组的转移患者在TARGET-OS和GSE21257数据集中的比例更高。
同时，来自转移样本的细胞ANGscore值在单细胞数据集中显著升高。在所有样本中，ANGscore评分低的样本具有更好的预后获益。总之，这些结果表明ANGscore是OS患者预后和免疫反应的可靠预测指标。
图7 ANGscore在OS预后和免疫治疗反应中的预测作用
ANGscore预测药物敏感性的有效性
为了识别患者的候选药物，作者利用ANGscore系统并计算了GDSC中药物的IC50值。结果发现大多数药物的IC50与ANGscore和血管生成基因表达成反比（图8a）。
作者在TARGET-OS和GSE21257数据集中探索了与ANGscore相关性最高的药物，发现AKT抑制剂优普色替的IC50值与两者的ANGscore呈正相关高分组与低分组之间存在显著性差异（图8b），而VE821、AZD6738、BMS.345541的IC50值在高分组中较低（图8c-e）。
这些结果表明，ANGscore高的OS患者可能对优普色替耐药，并对VE821、AZD6738和BMS.345541敏感。
图8 ANGscore预测药物敏感性
这篇文章的亮点是建立了一种新型的ANGscore系统，可以准确区分OS人群的预后和免疫特征。“免疫细胞”+“血管生成”双重热点加持，基于OS的血管生成模式构建预后模型，内容非常丰富，纯生信文章都能轻松发7+文章！
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