生信和实验双剑合璧，手把手教你拿下一区5分+，走上科研巅峰

生信热点方向可谓是更新越来越快啦！与此同时，纯生信文章也变得越来越受欢迎！这次小记者给大家解读一篇基于染色质调节因子对于肾缺血再灌注损伤发病机制的研究的生信分析文章！

小伙伴们都知道，同样的研究热点，对创新性要求很高，毕竟这样的研究比比皆是。这篇文章到底是凭借什么创新点一举拿下高分的呢？别急~等小记者和你们好好唠唠……

小记者今天介绍的这篇文章，看起来普普通通但实则很有亮点，该文章首次利用生物信息学方法分析染色质调节因子对于肾缺血-再灌注损伤(IRI)的作用，并且将生信与实验相结合，利用机器学习的分析结果辅助动物实验，实现双赢，稳拿一区5分+！

还没有思路吗？还在为创新点苦思冥想吗？

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缺血-再灌注损伤(IRI)是一种以器官灌注短暂减少或停止后供血恢复并伴有再氧合为特征的病理生理状态。肾IRI是各种形式急性肾损伤(AKI)的重要病理生理过程，在肾移植的背景下，手术过程中肾IRI是不可避免的，然而目前还没有有效的治疗方法可以预防或减轻肾IRI。肾IRI的病理生理机制非常复杂，几种染色质调节因子(Chromatin regulator, CRs)的失调与肾IRI相关。然而，CRs在肾IRI中的确切作用仍不明确，也没有系统的研究。先天性和适应性免疫反应的参与在肾IRI中也被很好地识别出来。不同免疫细胞的活化和招募在介导肾IRI的急性损伤和修复中具有重要作用。虽然免疫反应在肾IRI中具有重要的致病意义，但关于CRs和免疫反应细胞之间相互作用的数据有限。因此，了解CRs对于IRI发病机制的确切作用是很有必要的，有助于设计新的策略来避免或减轻肾IRI，从而改善急性肾损伤（AKI）或肾移植患者的整体临床结局。

识别3个GEO数据集中的交叉差异表达基因（DEGs），并对DEGs进行GO富集分析和KEGG富集分析。利用cytoHubba工具构建PPI网络，鉴定出2个hub基因GADD45A和GADD45B，通过hub基因构建列线图来预测肾IRI的风险。将来自WGCNA筛选的368个共表达基因与163个DEGs取交集，然后使用Enrichr在线工具构建交集基因网络，进一步分析KEGG富集通路，并使用ssGSEA算法分析了hub基因与29种浸润性免疫细胞和功能之间的关系。之后在metscape网站和GeneMANIA在线工具上构建基因到基因网络验证通路一致性，最后对DSigDB数据库和TargetScan数据库筛选靶向GADD45A和GADD45B的潜在miRs 药物。

首先作者在人肾IRI样本GSE43974数据集中筛选出163个DEGs，其中有153个过表达基因和10个下调基因(图2A)。然后使用支持向量机、随机森林和XGB极端梯度增强三种机器学习模型进一步分析了163个DEGs和870个CR相关的DEG基因，从中识别出5个交集基因(DUSP1, GADD45A, GADD45B, GADD45G, HSPA1A)，发现与对照组相比，HSPA1A和HSPA1A表达均显著上调(图2B)；之后进行GO富集分析，发现24个重要本体论术语，KEGG富集分析发现5个最显著的信号通路为MAPK信号通路、p53信号通路、细胞周期信号通路、FoxO信号通路和NF-κB信号通路(图2C)。

图2. 基于三种机器学习方法对人肾缺血再灌注

损伤(IRI) GSE43974数据集中染色质调节(CR)

相关差异表达基因(DEGs)进行功能富集分析

使用cytoHubba工具来分析5个交集基因的蛋白质相互作用(PPI)网络，发现GADD45A和GADD45B得分最高，并被选为后续分析的hub基因(图3A)；通过对GSE43974数据集中hub基因进行表达评分形成的CR相关列线图来预测肾IRI的风险，发现其对肾脏IRI具有良好的预测价值(图3B)；并利用两组数据集（GSE30718 和 GSE126805）验证风险评分模型，发现与对照组相比，肾IRI样本中GADD45A和GADD45B的表达均显著上调(图3C)，风险评分模型对肾IRI的预测效果良好(ROC AUC为0.859)(图3D)。

图3. 染色质调节因子(CR)相关预测人肾

缺血再灌注损伤(IRI)风险评分图的构建和验证

作者采用小鼠肾IRI模型进一步评估肾组织中GADD45A和GADD45B的表达，发现肾IRI组的SCr(血清肌酐)和BUN(血尿素氮)含量显著高于假手术组(图4A)；肾IRI组的肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂calin (NGAL)和肾损伤分子-1 (KIM-1) mRNA表达水平均高于对照组(图4B)；肾IRI小鼠表现出肾小管损伤的显著组织学特征，包括肾小管上皮细胞坏死和剥离，蛋白铸型的形成，以及刷状边界的消失(图4C,D)。IRI组与假手术组相比，GADD45A和GADD45B mRNA表达显著上调(图4E,F)。免疫组化染色显示与假手术组动物相比，肾IRI小鼠肾组织中GADD45A和GADD45B蛋白强度增加(图4G,H)。蛋白免疫印迹分析（Western blot）也证实了GADD45A和GADD45B蛋白表达水平的升高(图4I)。

图4. 利用小鼠肾缺血再灌注损伤(IRI)

模型验证生物信息学数据

作者进一步分析数据集中所有基因中方差最大的前25%(5188个基因)的基因。0.25的阈值首先用于合并相似性状相关基因(图5A)。作者选择β = 8(无尺度R2 = 0.85)作为软阈值(图5B)。将基因表达矩阵分为10个模块(图5C)，发现每个模块包含至少50个表达相似特征的基因，与GADD45A和GADD45B共表达最显著的模块是MEblack部分，其中包含368个基因(图5C)，368个共表达基因与肾IRI呈正相关(图5D)。

图5. 在肾缺血再灌注损伤(IRI)中使用

加权基因共表达网络分析GADD45A、

GADD45B的构建及共表达基因网络

首先在肾IRI组中WGCNA (加权基因共表达网络分析)选择的368个共表达基因和163个DEGs中一共筛选出152个交集基因，利用Enrichr在线工具构建152个交集基因的网络，根据k-means聚类分析，在一个PPI网络中，141个相应的蛋白被分为三个簇，分别包含63个、45个和33个蛋白(图6A)。进一步分析了基因簇1中KEGG富集的通路，包括GADD45A和GADD45B。KEGG通路显示共表达基因的GADD45A和GADD45B主要富集于TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、肿瘤的转录调控异常、IL-17信号通。NF-κB信号通路(图6B)。

图6. GADD45A、GADD45B及共表达基因在

肾缺血再灌注损伤中的通路分析

作者利用ssGSEA算法进一步分析了枢纽基因与29种浸润性免疫细胞和功能之间的关系。通过肾IRI差异分析确定了11组免疫细胞(图7A)；GADD45A与大多数类型的免疫细胞和功能呈负相关，而GADD45B与浸润性免疫细胞和功能呈正相关(图7B)。

图7. 利用单样本GSEA (ssGSEA)分析人肾缺血

再灌注损伤(IRI)中GADD45A和GADD45B

与浸润免疫细胞和功能的关系

GADD45A的表达与13种免疫细胞群体的比例差异有关，包括巨噬细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs）;GADD45B表达也与pDCs和活化树突状细胞(aDCs)比例的差异有关。由于pDCs是GADD45A和GADD45B表达的唯一交叉免疫细胞，之后进一步分析了GADD45A和GADD45B与pDCs细胞表面标记物(CLEC4C、NRP1和IRF8)的相关性。GADD45A的表达与CLEC4C呈负相关，与NRP1的表达呈正相关(图8A)，而GADD45B与IRF8的表达呈正相关(图8B)，验证pDCs与GADD45A和GADD45B之间的相关性，作者在小鼠肾IRI模型中进行了免疫荧光染色。实验显示，与假手术小鼠相比，肾IRI小鼠肾脏中BST2 (pDCs的特异性标记物)和GADD45A双阳性浸润性pDCs的数量减少(图8C,E)。与此同时，小鼠IRI组中GADD45B+BST2+ pDCs浸润较多(图8D,F)。结果与ssGSEA分析结果一致。接下来在Metascape网站和GeneMANIA在线工具上构建了一个基因-基因网络，发现MAPK通路和I型干扰素反应与ssGSEA和KEGG通路一致(图8G)。

图8.人肾缺血再灌注损伤(IRI)中GADD45A和

GADD45B表达与浆细胞样树突状细胞(pDCs)

细胞表面标志物的相关性分析

根据肾IRI数据集中GADD45A和GADD45B基因表达的中位值将其分为低表达组和高表达组。低GADD45A表达与免疫细胞浸润增加和免疫功能增强相关(图9A)。GADD45B的过表达与更高的DCs、iDCs、pDC浸润以及I型干扰素反应的表达和炎症促进功能显著相关(图9B)。

图9. 人肾缺血再灌注损伤中GADD45A和

GADD45B低/高表达的免疫相关性分析。

作者通过相互作用网络分析确定靶向GADD45A和GADD45B及其相关microRNAs (miRs)的药物。在DSigDB数据库和TargetScan数据库中筛选靶向GADD45A和GADD45B的miRs药物。结果显示GADD45A和GADD45B可能是beta-七叶素、舍曲林、伯氨喹、匹莫齐特和氮杂环诺的潜在靶点。此外，hsa-miR-331-5p和hsa-miR-127-3p可能分别是GADD45A和GADD45B有希望的相互作用miRs药物(图10)。

图10. 相互作用网络显示肾缺血再灌注损伤、

GADD45A、GADD45B和相关

microRNAs (miRs)的潜在治疗方法

这个文章在机器学习的应用、分析思路和验证实验设计上都有比较高的创新性，即使分析内容简单，数据量不是很大，但集各种亮点于一体的整体文章设计，它首次使用生物信息学方法系统地分析了肾IRI中CR、临床结果、免疫反应和潜在小分子药物之间的关系。该发现具有临床意义，因为它们为重新利用抗精神类药物治疗肾IRI提供了科学依据。虽然此研究发现了GADD45A和GADD45B可能在MAPK通路中发挥重要的致病作用，但结果还需要通过基础/动物实验和肾IRI患者的临床样本进一步验证。感兴趣的朋友，码住这个思路行动起来吧！