中医药人的福利来咯！山东中医药大学马柯团队：网络药理学与分子对接完美融合成功拿下7.9分！

有小伙伴问小记者，中医药方向咋发生信文章？那你可问对人了，要说中医药和什么生信研究最对口，那非网络药理学莫属了！近几年，网络药理学越来越多地被研究人员用于传统中医的生物学研究。然而，网药文章越来越多，怎样做才能脱颖而出呢？

今天小记者就给小伙伴们推荐一篇思路新颖的高分文章。首先这篇文章通过质谱分析鉴定百合地黄汤含药血清（LBRDDS）的活性成分，又对SD大鼠盲肠内容物进行16S rRNA测序，并通过CORT诱导的神经细胞毒性法研究LBRDDS的神经保护作用，这一系列研究给文章上了大分，直接给这篇文章的湿实验拉到了满分。接着通过网络药理学，分子对接，免疫荧光、功能增减实验等多种实验方法探索LBRDDS潜在的药理学机制。网络药理学分析玩出的花样终归是停留在表面，而本研究这种层层深入的逻辑很好的说明中药如何发挥作用，文章逻辑清晰，干湿结合，范围研究深入，文章质量杠杠滴！

这不就是网药SCI优秀发文模板吗？这种网药和分子对接及湿实验整合的思路，对于中医药研究真的再适合不过啦! 想要发表高分SCI的小伙伴们也可以借鉴一下本文的研究思路哦~(ps：不知道怎么创新的小伙伴可以来找小记者！这里有新鲜出炉的生信热点方向，还有一大波的可复现的创新思路，感兴趣的直接扫码联系我吧！)。

• 题目：两种天然药用植物通过纠正神经递质缺失和炎症失衡对CORT诱导的神经细胞损伤的协同神经保护作用

• 杂志：Phytomedicine

• 影响因子：IF=7.9

• 发表时间：2023年9月

  后台回复“999”获取原文，文献编号231226

             

研究背景

抑郁症是一种严重的情绪障碍，其特征是持续感到悲伤和失去兴趣。它通常导致多种心身症状，复发率高，自杀率高，死亡率高。中药具有多成分、多靶点、协同作用强、副作用少的特点，在抑郁症的临床治疗中发挥了重要作用。百合和地黄是治疗抑郁症的传统天然药用植物，但百合地黄汤含药血清 (LBRDDS)在体外抑郁症模型中的抗抑郁机制尚未阐明。

数据来源

研究思路

本文采用UHPLC-Q-TOF/MS方法鉴定LBRDDS的活性成分。对SD大鼠盲肠内容物进行16S rRNA测序，研究百合地黄汤（LBRD）对肠道微生物群的影响。然后，检索gutMGene数据库确定LBRDDS中可以直接调节肠道菌群的化学成分。利用CORT诱导的神经细胞毒性法研究LBRDDS的神经保护作用。通过SEA Search Server Databas预测LBRDDS的靶基因。从GeneCards、OMIM、Disgenet、Therapeutic target Database等数据库中检索抑郁症的靶基因。将LBRDDS靶基因与抑郁症靶基因进行比对，确定重叠基因。将重叠基因导入STRING数据库，利用CytoNCA插件寻找核心基因，并对得到的核心靶基因进行富集分析。利用Cytoscape软件构建LBRDDS关键组分与靶基因之间的调控网络，并通过 Auto Dock Tool软件进行分子对接。从蛋白质数据库下载蛋白质的三维结构，并从ChemSpider数据库中检索分子配体的三维结构。将蛋白质和配体的三维结构文件上传到CB-Dock2网站进行自动对接。最后通过免疫荧光、功能增减实验等探索LBRDDS潜在的药理学机制。    

主要结果

1. UHPLC-Q-TOF/MS法鉴定血中吸收的LBRD

不同的化学成分在不同的扫描模式下显示出不同的峰，本研究的质谱分析采用正离子和负离子模式扫描。空白血清、LBRD和LBRDDS的总离子电流谱如图1所示。经过去重复分析，最终确定了LBRDDS中的33种成分(表1)。

图1 LBRD、空白血清和LBRDDS样品天然产物鉴定的总离子流图

表1 33种LBRDDS成分

2. LBRD调节肠道微生物群的多样性和组成

为了研究LBRD对肠道微生物群的影响，本研究对SD大鼠盲肠内容物进行了16S rRNA测序分析。结果发现，与空白对照组相比，LBRD组肠道菌群结构和多样性发生了变化，组间差异主要集中在科、属和种上，其中厚壁菌门丰度降低，放线菌门、变形菌门、拟杆菌门、微内菌门丰度升高(图2A-C)。然后，根据LEfSe分析的β多样性得出，与空白对照组相比，LBRD组的拟杆菌门、细杆菌门、微孢子门、拟杆菌门、微球菌门、拟杆菌门、微球菌科、白孢菌科、罗氏菌科和魏氏菌科的丰度存在显著差异(图2D)。

图2 LBRD调节肠道菌群的多样性和组成

3. LBRDDS成分及靶基因的网络药理学分析

SEA Search Server数据库共预测了1131个LBRDDS靶基因，并与GeneCards、OMIM、Disgenet、Treatment target database和Genecard数据库中的抑郁症靶基因重叠，并加入RNA-seq基因，共得到108个核心基因。对关键靶基因进行GO富集分析，生物过程(图3A)涉及脂肪酸代谢过程、CAMP介导的信号、羧酸转运、有机酸转运、长链脂肪酸代谢过程。细胞组分(图3B)包括突触膜、GABA受体复合物、突触前膜、GABA- A受体复合物、GABA能突触。分子功能(图3C)涉及金属肽酶活性、前列腺素受体活性、神经递质受体活性、GABA受体活性、金属肽酶活性。关键靶基因的KEGG途径间的相关性如图3D所示，GABA能突触、谷氨酸能突触和血清素能突触通路密切相关，相互调节。

图3 LBRDDS成分及靶基因的网络药理学分析

4. LBRDDS组分与靶基因的分子对接

本研究选取血清代谢物棕榈酸、肾上腺酸、亚油酸、花生四烯酸、11,12-环氧二烯酸、二十二碳五烯酸及关键抑制靶基因FABP3 、MAPK3 、RELA 、AKT1、FAAH 、EPHX2 导入CB-Dock2进行分子对接。对接过程分三次进行，如表2所示。同时，FAAH与肾上腺酸、FAAH与亚油酸、FAAH与花生四烯酸、FAAH与11,12-环氧二烯酸、FAAH与二十二碳五烯酸、EPHX2与11,12-环氧二烯酸的分子对接可视化图如图4A-F所示。分子对接结果如图4G所示，结果显示FAAH与多个组分的结合能最低，表明其结合亲和力最强。因此，FAAH可能是调控肠道菌群和代谢功能最重要的靶基因。为了验证预测的分子对接靶基因，本研究采用qRT-PCR检测CORT 600 μM组和10% LBRDDS组神经2a细胞中FAAH和EPHX2的表达。结果显示，与CORT处理组相比，LBRDDS组FAAH和EPHX2的表达水平显著降低(图4H)。以上结果提示FAAH和EPHX2在LBRDDS的神经保护中起重要作用。

表2 抑制核心靶基因与组分分子对接的结果(kJ/mol)

图4 LBRDDS核心成分与靶基因的分子对接

5. LBRDDS对神经细胞损伤模型的保护作用

本研究对初级皮质神经元进行免疫荧光双染色鉴定后，进行DAPI、微管蛋白和MAP2染色，并将图像合并(图5A)。结果表明，100 μM、200 μM、400 μM、600 μM、800 μM的CORT处理24 h后，原代皮质神经元、PC12和神经2a细胞的存活率均有不同程度下降。原代皮质神经元、PC12细胞(CORT 400 μM)和神经2a细胞(CORT 600 μM)的细胞活力显著降低至50%左右(图5B和图6A、D)。因此，本研究确定CORT 400 μM作为原代皮质神经元和PC12细胞模型的干预浓度，CORT 600 μM作为神经2a细胞模型的作用浓度进行后续细胞实验。   

接下来，在抑郁细胞模型中检测不同浓度LBRDDS对细胞活力和LDH细胞毒性的保护作用。结果显示，与对照组相比，模型组细胞存活率显著降低。与模型组比较，5% LBRDDS可显著提高原代皮质神经元存活，10%的LBRDDS可显著提高PC12细胞和神经2a细胞的存活率(图5C和图6B、E)。同时，与对照组相比，模型组LDH细胞毒性显著升高。与模型组比较，LBRDDS组LDH细胞毒性显著降低(图5D和图6C、F)。LDH水平是细胞膜完整性的重要指标，通过检测细胞质膜破裂细胞释放到培养物中的LDH水平，可以定量分析细胞毒性。对照组(CORT 400 μM, 5% LBRDDS)的初级皮质神经元细胞模式图像如图5E-G所示。对照组，CORT 400 μM, 10% LBRDDS的PC12细胞图像如图6G - I所示。对照组，CORT 600 μM, LBRDDS(10%)的神经2a细胞模式图像如图6J-L所示。这些结果表明，CORT 400或600 μM处理后，神经细胞存活率显著降低，LDH细胞毒性增加，而5%或10%的LBRDDS可提高神经细胞存活率，保护细胞完整性，降低LDH细胞毒性，减少神经细胞死亡，减轻细胞损伤。

图5 LBRDDS对皮质神经元原代损伤模型活力的影响

图6 LBRDDS对CORT诱导的PC12和神经2a细胞损伤模型活力的影响

6. LBRDDS对神经递质和炎症因子的影响

原代神经元细胞实验结果如图7A-E所示。与对照组比较，模型组(cort400 μM) 5-HT、GABA、IL-10表达水平显著降低，Glu、IL-1β表达水平显著升高。相反，与模型组相比，5% LBRDDS显著提高了5- HT、GABA和IL-10的表达水平，显著降低了Glu和IL-1β的表达水平。PC12细胞的实验结果如图7F-J所示。与对照组比较，模型组(cort400 μM)大鼠5-HT、GABA、IL-10表达水平显著降低，Glu、IL-1β表达水平显著升高。相反，与模型组相比，10% LBRDDS组显著提高了5-HT、GABA和IL-10的表达水平，显著降低了Glu和IL-1β的表达水平。在神经2a细胞上的结果如图7K-O所示。与对照组比较，模型组(CORT 600 μM)大鼠5- HT、GABA、IL-10表达水平显著降低，Glu、IL-1β表达水平显著升高。相反，与模型组比较，10% LBRDDS组大鼠5-HT、GABA、IL-10表达水平显著升高，Glu、IL-1β表达水平显著降低。这些结果表明，CORT干预可诱导神经元出现抑郁样表型，导致E/I失衡，炎症水平升高，而LBRDDS可逆转神经递质和炎症因子水平，保护神经元细胞免受CORT损伤，具有良好的神经保护作用。

图7 LBRDDS对CORT诱导的细胞损伤模型神经递质和炎症因子的影响

7. LBRDDS调节miRNA-144-3p的表达介导GABA的合成和转运

为了探讨LBRDDS对神经细胞损伤模型中GABA水平影响的分子机制，本研究采用qRT-PCR和WB分析GABA合成(Gad67)和释放(VGAT)相关基因和蛋白的表达水平。如图8A-C所示，CORT 600 μM干预神经2a细胞导致miRNA-144-3p表达增加，Gad67和VGAT基因表达水平降低，而10%的LBRDDS显著逆转了这些变化。蛋白表达与qRT-PCR结果一致，10% LBRDDS显著提高了细胞模型中Gad67和VGAT蛋白的表达水平(图8D-F);质粒转染后48 h的GFP荧光强度证明转染实验成功(图8G)， qRT-PCR结果显示，与CORT 600 μM组相比，miRNA-144-3p抑制剂+ CORT 600 μM组和CORT 600 μM + 10% LBRDDS组miRNA-144-3p表达降低;Gad67、VGAT表达增加。与CORT 600 μM + 10% LBRDDS组相比，miRNA-144-3p OE + CORT 600 μM + 10% LBRDDS组miRNA-144-3p表达水平显著升高，Gad67、VGAT表达水平显著降低(图8 H-J)。GABA水平与qRT-PCR结果一致。与CORT 600 μM + 10% LBRDDS组相比，miRNA-144-3p OE + CORT 600 μM + 10%LBRDDS组中miRNA-144-3p表达水平显著升高，而Gad67和VGAT表达水平显著降低 (图8H-J)。这些结果表明，miRNA-144-3p可以靶向负调控Gad67和VGAT基因的表达。10% LBRDDS通过调节miRNA-144-3p介导的GABA合成和转运功能，提高GABA浓度，从而减轻CORT对神经细胞的损伤，并起到抗抑郁的作用。

 图8 LBRDDS通过miRNA-144-3p介导的GABA合成、转运和释放来缓解E/I失衡

文章小结

这篇文章可谓是中医药研究的模板！既利用了质谱分析和16S rRNA测序，研究LBRDDS的活性成分及LBRD对肠道微生物群的影响。同时通过网络药理学，分子对接，免疫荧光、功能增减实验等方法探索LBRDDS潜在的药理学机制。本研究可能为天然药用植物的发育突破以及抑郁症的发病机制提供分子基础。看到别的团队蹭蹭蹭地发文，你是不是也迫不及待准备大展身手啦？想在中医药方向做点新东西的小伙伴，不要错过这个好思路，想复现的小伙伴们快快扫码联系小记者吧！

小记者话生信

如果您的时间和精力有限或者缺乏相关经验，并且对生信分析和课题设计有所需要的话，【生信日报】可以提供特色数据库构建、免费思路评估、付费生信分析和方案设计以及实验项目实施等服务，感兴趣的朋友可以咨询小记者哦！

往期推荐

• 细胞焦亡引领者邵峰院士携手丁璟珒团队再发Nature：揭秘非经典炎症小体通路如何识别与活化IL-18！

• 中山二院宋尔卫/苏士成实验室患癌事件后续，团队1周内接连发表Cell和Nature···
  

• 注意！这个8分+『NHANES数据库分析友好期刊』On hold了！可能会被踢出SCI ···
  

• 只用了1种分析方法的纯生信拿下了9+？？拒绝假大空，高分滚滚来！！！
  

• 5分+的纯生信分析还全靠公共数据库，发到中科院二区top是不是很划算？