中医药在中国已经广泛使用了千年，在改善健康以及预防和治疗各种疾病中显示出了巨大潜力。然而，大多数中医药的生物学原理仍有待确定。近年来，随着对肠道菌群的研究越来越火热，中医药和肠道菌群之间的双向对话也被人们广泛关注。那么中医药对肠道菌群有什么影响呢？从肠道菌群入手又如何助力研究中医药药理特性呢？如何融入多组学研究去探索二者的相互作用机制呢？
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今天小记者给小伙伴们带来香港中文大学于君教授团队在Gastroenterology上发表的一篇文章，题为《Traditional Medicine Pien Tze Huang Suppresses Colorectal Tumorigenesis Through Restoring Gut Microbiota and Metabolites》。该研究发现片仔癀操纵肠道微生物群和代谢物，改善肠道屏障功能，抑制致癌和促炎途径，从而抑制结直肠癌变。该研究一发表，震惊世界，也被评委“2023最受瞩目的中国十大研究”，也可见我国科学家在慢慢推进“中医药现代化”，使咱中医药研究逐渐打破壁垒，走向国际！
于君教授, 教授、博士生导师，现任香港中文大学医学院助理院长、香港中文大学消化道肿瘤实验中心主任。于君教授长期致力于消化系统肿瘤机制和防治研究。发表SCI论文400余篇（影响因子10以上85篇）。主编英文专著2部，参与编写英文专著12部。国内外专利30多项。获得 “医学药学奖”、国家科技进步奖二等奖（2项）、国家科技进步创新团队、高等院校科学研究优秀成果奖（3项）等国家级奖励30余项。在2023年9月，于君教授团队在知名学术期刊《Gastroenterology》在线发表了一项引人注目的研究，题为"Traditional Medicine Pien Tze Huang Suppresses Colorectal Tumorigenesis through Restoring Gut Microbiota and Metabolites"。该研究深入探究了中药片仔癀（PZH）如何以剂量依赖的方式抑制结直肠癌（CRC）的发生，并发现肠道微生物及其代谢产物在其中扮演了关键角色。这项研究一经发布，引起国内外轰动，可见其在中医药领域创造了一个多么重大的突破。研究中医药的小伙伴，想要进军国际顶刊的，不要错过这个方向哦！(ps：不知道怎么创新的小伙伴可以来找小记者！这里有新鲜出炉的生信热点方向，还有一大波的可复现的创新思路，感兴趣的直接扫码联系我吧！)。
小记者细细阅读了这篇文章，发现这篇文章有以下四大亮点：1. 利用自发性结直肠癌和无菌小鼠模型研究了片仔癀-肠道菌群交互作用在预防结直肠癌中的作用，并证明了片仔癀能够抑制结直肠癌的发生；2. 片仔癀通过丰富肠道中的益生菌及其有益代谢产物来逆转结直肠癌相关的肠道生态失调；3. 在无菌或抗生素治疗的小鼠中检测了片仔癀对结直肠癌的化学预防效果；4. 阐明了肠道菌群和片仔癀代谢产物之间的潜在相互作用。这篇文章从动物、细胞、类器官三个层面展开研究，整个实验设计相当精彩，跟小记者一睹为快吧！
研究背景
结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。近年来，随着生活水平的提高和饮食习惯的改变，我国结直肠癌发病率呈显著上升的趋势，由结直肠癌带来的健康问题日益严峻。片仔癀（PZH）是一种公认的传统药物，对炎症和癌症的治疗均有重要作用，现有研究表明其能通过抑制细胞增殖来抑制结直肠癌。然而，片仔癀作用的生物学基础以及其与肠道菌群之间的潜在相互作用仍未被探索。
主要结果
首先 , 为了探讨PZH在结直肠癌发生中的化学预防作用，作者以270 mg/kg(低)或540 mg/kg(高)的剂量给AOM/ DSS处理的C57BL6小鼠灌胃PZH。结果发现，PZH剂量依赖性地抑制CRC发病率，对照组、低剂量PZH组和高剂量PZH组的肿瘤发病率分别为100%、66.67%和37.5%。高剂量PZH治疗也能显著抑制肿瘤数量和大小。与此相一致，通过H&E和Ki-67染色评估发现，大剂量PZH治疗可显著降低结肠癌的发病率，抑制细胞增殖。接下来，作者验证了PZH在Apcmin/+小鼠中的化学预防作用。一致地，在Apcmin/+小鼠中高剂量PZH治疗显著减少结肠肿瘤数量和大小。此外，高剂量PZH降低了结肠癌的发病率和增殖细胞百分比。因此，PZH在致癌物质诱导的CRC模型和转基因Apcmin/+ CRC模型中具有化学预防作用（图1）。
图1 PZH剂量依赖性地阻止AOM/ DSS处理小鼠和Apcmin/+小鼠的结直肠癌发生
随后，为了确定PZH是否在结直肠癌发生过程中调节肠道微生物群，作者对2种结直肠癌模型的粪便样本进行了霰弹枪宏基因组测序分析。结果发现，PZH治疗显著增加了α-多样性，主坐标分析的β-多样性显示，在两个CRC模型中PZH重塑了肠道微生物群。此外，在AOM/DSS模型中，PZH处理增加了包括嗜酸乳杆菌、鸡乳杆菌、乳酸菌和约翰逊乳杆菌在内的益生菌，同时减少了致病菌空肠弯曲杆菌、哈氏胃杆菌、维罗氏气单胞菌、和产气柯林斯菌。接下来，作者利用PZH和对照组之间发现的差异细菌构建生态网络。在PZH处理的小鼠中，益生菌与致病菌之间存在共负相关，这表明PZH富集的益生菌可能拮抗CRC致病菌。随后，作者研究了富含PZH的益生菌（P xylanivorans和E limmosum）在CRC中的功能。研究发现，P xylanivorans或E limosum的培养上清液可显著抑制结直肠癌细胞(DLD1和HT-29)的活力和集落形成，而对正常结肠上皮细胞(NCM460)没有影响。为了确定肠道微生物群和代谢物是否支持PZH在结直肠癌中的化学预防作用，将PZH处理(PZH粪便微生物群移植[FMT])或载体处理(对照-FMT)常规小鼠的粪便样本灌胃给AOM/DSS处理的无菌小鼠。与AOM/ DSS处理的无菌小鼠的对照FMT相比，PZH-FMT显著减少结肠肿瘤数量和负载。这些数据表明，PZH的抗癌作用至少部分依赖于微生物群（图2）。
图2 PZH治疗可逆转微生物生态失调
然后，鉴于肠道微生物群分泌的代谢物在调节健康和疾病中发挥重要作用，作者接下来在AOM/DSS模型和Apcmin/+模型中对高剂量PZH治疗小鼠和对照小鼠的粪便样本进行了代谢分析。PCA和PLS-DA分析均显示，在两种CRC模型中，PZH组和对照组的代谢组明显分离。AOM/DSS模型中，35种代谢物在PZH处理小鼠的粪便中与对照小鼠相比显著改变。通过LC-MS对片仔癀成分和这些代谢物并排比较发现这些代谢物中有7种来自片仔癀。途径富集分析显示，PZH上调了牛磺酸和次牛磺酸代谢、初级胆汁酸生物合成和不饱和脂肪酸生物合成。为了将这些代谢物与肠道微生物的潜在代谢活动联系起来，作者对改变的细菌和代谢物进行了综合分析。结果发现益生菌L gallinarum与TCA呈正相关， P xylanivorans和E limosum与16-羟基十六酸和戊二酸呈正相关。此外，P xylanivorans、E limmosum、L gallinarum和L acidophilus与蓖麻油酸和SDA呈正相关。然而，致病菌P harei、C aerofaciens、A veronii和C aerofaciens与蓖麻油酸、SDA和16-羟基十六酸呈负相关(图3)。
图3 PZH改变粪便中与肠道微生物相关的代谢物
接下来 ，为了评估PZH是否会影响肠道屏障功能，作者对AOM/ DSS和Apcmin/+小鼠模型进行了FITC-葡聚糖肠道通透性测定。结果发现，高剂量PZH显著降低了AOM/ DSS处理小鼠和Apcmin/+小鼠的血清FITC -葡聚糖水平。作者还测试了血清细菌脂多糖，这是肠道屏障完整性的另一个标志，在高剂量PZH组中持续降低。与此一致，PZH通过透射电镜恢复了肠道屏障结构。通过免疫组化实验发现，片仔癀处理的小鼠紧密连接蛋白E-cadherin和ZO-1表达升高。Western blot和PCR结果显示，PZH显著提高了E-cadherin、Occludin和ZO-1水平，这些发现表明PZH -肠道微生物群轴可能有助于肠道屏障功能的恢复（图4）。
图4 PZH可恢复CRC肠道屏障功能障碍
接下来，为了深入了解PZH在结直肠癌中的肿瘤抑制作用，作者对2种结直肠癌模型的大块结肠组织进行了RNA测序。与对照组小鼠相比， PZH处理小鼠中有588个基因上调，373个基因下调。KEGG分析发现，PZH处理后，PI3K - Akt信号通路下调幅度最大。为了支持这一点，PZH治疗抑制了两种结直肠癌模型结肠组织中p-Akt的表达。由此可见，PZH抑制结直肠癌中致癌PI3K-Akt信号通路。RNA测序结果表明，PZH可以抑制 IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路。在AOM/DSS模型中，通过小鼠炎症反应和自身免疫聚合酶链反应阵列，PZH治疗后，21个编码细胞因子及其受体的基因一致减少。通过PCR实验证实，PZH处理后结肠组织中的Ccl2、Cxcl2、Cxcl5、TNF-a和Il17a信使RNA下调。此外，Elisa实验证实小鼠血清中Cxcl5和TNF-a水平降低。总的来说，这些数据表明PZH对CRC的影响是由致癌和免疫相关的信号级联介导的（图5）。
图5 PZH抑制结肠上皮中致癌PI3K-Akt通路和促炎通路的表达
接下来，作者在无菌小鼠中评估了AOM/DSS诱导的结直肠癌发生。与常规无菌小鼠相比，无菌小鼠的结直肠癌发生减少。此外，PZH在无菌小鼠中比常规小鼠具有更强的化学预防作用。为了验证这一点，作者对有无PZH的无菌小鼠进行了代谢组和转录组研究。PCA和PLS-DA分析显示，经AOM/ DSS处理的无菌小鼠中PZH组和对照组明显分离。在271个缺失和327个富集的样本中，作者发现在PZH处理的无菌模型和传统的AOM/DSS模型中，16-羟基十六烯酸、CA、TCA和青卡绿素的富集是一致的。此外，作者在小鼠粪便样本中检测到54种PZH成分，与对照小鼠相比，PZH处理的常规小鼠和无菌小鼠中也持续显著富集PZH。RNA测序证实PZH处理无菌小鼠的炎症信号通路下调，与传统的AOM/DSS模型相似，这表明PZH成分可以抑制结直肠癌的炎症。与此一致，PZH恢复了AOM/ DSS处理的无菌小鼠的肠道屏障功能，这可以通过下调血清FITC -葡聚糖和脂多糖以及紧密连接蛋白的表达来证明。为了阐明肠道微生物群对PZH恢复肠道屏障功能的贡献，作者将PZH处理的常规小鼠的粪便分离成细菌(PZH-bac)和代谢物(PZH-met)部分，然后移植到AOM/ DSS处理的小鼠中。PZH-bac和PZH-met都能部分恢复肠道屏障功能，抑制结直肠癌的发生（图6）。
图6 PZH的化学预防作用包括依赖微生物群和不依赖微生物群的成分
最后，作者研究了PZH的活性成分。分别在熟肉培养基和含PZH的BHI培养基中，在好氧或厌氧条件下培养PZH处理小鼠的粪便样本。接着用靶向UHPLC-QE-MS分析这些样品中的片仔癀成分。结果发现，多种人参皂苷被好氧微生物下调。接下来，作者观察到G-Re和G-F2抑制DLD1和HT- 29细胞的增殖，而对NCM460细胞没有影响。G-Re和G-F2抑制DLD1和HT-29细胞集落形成，并直接抑制结直肠癌细胞中的致癌和促炎信号。此外，作者使用或不使用G-Re和G-F2治疗患者来源的CRC类器官(74、816、828和1482)，证明G-Re和G-F2显著抑制CRC类器官的生长。综上所述，这些结果表明PZH成分G-Re和G-F2可以直接在结直肠癌中发挥肿瘤抑制作用（图7）。
图7 PZH抗癌人参皂苷对结直肠癌有直接的化学预防作用
小结
本研究发现PZH通过调整肠道微生物群和代谢物的平衡，成功地抑制了结直肠癌的发生。肠道微生物与PZH代谢物之间的相互作用被认为是其治疗效果的关键因素。总之，本文为片仔癀与肠道微生物群之间复杂的相互作用提供了见解，并为利用片仔癀预防结直肠癌的未来策略提供了信息。这项研究是中医药领域的重大突破，想在中医药方向做点新东西的小伙伴，还在等什么？就算不像大佬这样做的这么深入，但只要跟住大佬的步伐，创新思路，再加上生信分析，高分文章不是手到擒来嘛！况且还有小记者帮你创新思路，帮你搞定生信技术！有需要的小伙伴快快扫码联系小记者吧！
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