数据不会说谎，让我们用事实说话。大家好，这里是盼星星盼月亮终于迎来端午假期的小记者。不知道大家是喜欢甜口还是咸口粽子呢，小记者则是忠实的咸口粽粉丝。今天带来的文章就像精心包裹的粽子一样，外表简单，内心却蕴含着多种值得我们学习的研究方法，就让小记者带大家一一揭示吧。
温馨提示，本篇文章生信含量极高，尤其适合临床医生体质的宝宝，仅需一点点功能验证。今天小记者将带您一窥这篇由弗吉尼亚大学于2023年11月28日发表在《Cell report》的文章（IF 8.8）。下面先带大家细数本文的亮点吧：
1.荟萃分析：通过整合22个单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集，生成了一个全面的人类动脉粥样硬化图谱。同时结合了全基因组关联研究(GWAS)数据，为疾病机理提供了遗传层面的证据。
2.干湿结合：通过组织切片、免疫荧光和RNAscope原位杂交等技术，对候选标记物在蛋白质水平上的表达进行了验证，增强了研究结果的可信度。（ps：对于这个思路，小伙伴们有没有兴趣应用在自己的研究中呢！如果手里有临床数据却不知如何开展生信分析或研究思路的，欢迎扫码找小记者交流哦。）
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题目：整合单细胞荟萃分析揭示了人类动脉粥样硬化中与疾病相关的血管细胞状态和标志物
杂志：Cell reports
影响因子：8.8
发表时间：2023.11.28
研究背景
冠状动脉疾病（CAD）是全球死亡和发病主要原因之一，其主要病理特征是动脉粥样硬化，即动脉壁内的斑块积累，可能导致血栓、心肌梗死或中风。这一过程涉及复杂的免疫和血管细胞间的相互作用和状态转变。近来，单细胞测序技术的出现使得我们能够在单细胞水平上研究基因表达和调控，但由于样本限制和技术因素，各研究结果可能存在差异。
数据来源
数据集/队列 |
数据库 |
数据类型 |
详细信息 |
GSM4705589 |
GEO |
scRNA-seq |
动脉粥样硬化斑块，三名白人欧洲患者 |
GSM4837523 |
GEO |
scRNA-seq |
严重颈动脉VII型钙化斑块，六名男性患者 |
GSM3819856 |
GEO |
scRNA-seq |
动脉粥样硬化病变，八名患者 |
6032099 |
Zenodo |
scRNA-seq |
心力衰竭（无动脉粥样硬化病变），五名患者 |
研究思路
这篇文章通过综合单细胞转录组分析，构建了一个涵盖118,578个细胞的人类动脉粥样硬化图谱，涉及多种细胞类型和状态。研究者首先对22个单细胞测序数据集进行了质控和标准化处理，然后进行批次校正整合数据，并系统性地注释了细胞类型。接下来利用基因表达特异性矩阵和GWAS数据，识别出与心血管疾病相关的细胞类型和效应基因。此外，研究者还分析了细胞间的通讯网络，通过拟时序分析追踪了平滑肌细胞表型转变的过程，并推断了关键转录因子的活性。最后通过组织切片和原位杂交实验，在蛋白质层面上验证了关键标记物的表达和定位。研究流程图如下。
研究流程图
主要结果
1.构建泛癌症肿瘤-正常单细胞宏图谱
研究者整合了四个不同的数据集，包括动脉粥样硬化病变和非病变冠状动脉的数据。使用标准化的质量控制流程，并在筛选后观察到细胞簇的分离和聚集得到改善（图1）。通过rPCA整合得到了118,578个高质量细胞和41个Louvain簇。随后使用手动和自动方法对细胞簇进行了注释，首先在UMAP空间标记细胞谱系名称（第一级），然后进一步解析细胞亚型（第二级）。这些注释得到了相应Marker基因的支持（图2A，B）。观察到各研究中巨噬细胞和内皮细胞的数量相对均衡，但在某些研究中，平滑肌细胞和T/自然杀伤细胞略有偏多。冠状动脉数据集中纤维细胞的比例较高，病变样本中B细胞、浆细胞和浆细胞样树突细胞（pDCs）的比例较高（图2C，D）。
图2A-D 细胞簇注释、标记基因表达、细胞类型分布、1级注释UMAP图
2.确定复杂性状的候选病因细胞类型
研究者利用细胞类型特异性基因签名和GWAS汇总统计数据来定义复杂性状的病因细胞类型。通过计算ESμ（图2E）、使用LDSC-SEG和MAGMA模型，分析了心血管疾病和非心血管疾病的GWAS数据。结果显示，平滑肌细胞（SMC）和周细胞基因签名在冠心病（CAD）、冠状动脉钙化（CAC）和心肌梗死（MI）等心血管性状中显著富集，而内皮细胞（EC）签名在颈动脉斑块关联中富集（图2F）。此外，巨噬细胞注释与阿尔茨海默病和白细胞计数的遗传性显著相关。进一步分析发现，病变样本中的SMC主要富集在CAC。
图2E-F 基因表达特异性和LD 评分回归、MAGMA分析
3.人类动脉粥样硬化中细胞亚型异质性的确定
研究者通过结合自动和手动注释，分析了41个细胞簇的异质性，绘制了人类动脉粥样硬化中细胞多样性的详细图谱（图3A）。
内皮细胞展示了多种亚群（图3A，B），包括经典内皮细胞（PECAM1, CLDN5）、内膜内皮细胞（RAMP2）、促血管生成内皮细胞（ACKR1, AQP1, FABP4）和促炎性内皮细胞（SELE, CCL2），以及表现出内皮-间充质转化的细胞（COL1A2, FN1）和淋巴管内皮细胞（LYVE1, CCL21）。
髓样细胞包括炎性巨噬细胞（IL1B, TNF）、泡沫细胞（APOE, FABP5）、驻留巨噬细胞（LYVE1, FOLR2）、经典单核细胞（S100A8, S100A9, LYZ）、常规树突状细胞（CD1C, CLEC10A），以及浆细胞样树突状细胞和中性粒细胞（NAMPT, S100A8）。
淋巴细胞多样性体现在NK细胞和多种T细胞亚群（CD69, CD8A/B）、B细胞（CD79A, CD79B）和浆细胞（IGLC2, IGHM, JCHAIN）上。成纤维细胞中，除了表达传统成纤维细胞标记（LUM, DCN）外，还包括活化成纤维细胞（ACTA2, C3, C7）和表达APOE的成纤维细胞（CXCL12, CXCL14）。
图3A-B 动脉粥样硬化细胞亚群(2级)和骨髓亚型在疾病状态中的分布
在病变样本中，炎性巨噬细胞、泡沫细胞、促炎性内皮细胞及活化成纤维细胞更为常见，而B细胞、浆细胞和浆细胞样树突状细胞在非病变样本中显著减少（图3C，D）。
图3C-D 动脉粥样硬化细胞亚群(2级)和骨髓亚型在疾病状态中的分布
4.人类动脉粥样硬化中SMC的表型特征
使用UCell R包对人类SMC、周细胞和部分成纤维细胞进行基因模块富集分析，发现人类SMC表型的转变特征，与小鼠SMC的收缩表型逐渐丧失和Lgals3转变基因特征的获得一致（图4A）。研究还鉴定出与小鼠钙化促进纤维软骨细胞（FCs）相似的基因特征，并通过差异表达标记和UCell模块富集分数，将SMC注释为收缩型、富含ECM的转变型SMC、纤维肌细胞和FCs（图4B，C）。
观察到收缩型SMC、转变型SMC和纤维肌细胞在不同动脉和病变状态中的比例相似，而FCs在病变样本中占主导地位。SMC、转变型SMC、纤维肌细胞和FCs富集了相关的生物过程，验证了注释方法。此外，还鉴定出富含转变型SMC基因特征并表达脂质代谢基因（APOE, APOC1, AGT）的细胞簇，称为“泡沫状”SMC（图4B，C），这些细胞表达ECM重塑基因（TIMP1）和促炎基因（CCL19, CCL2, IGFBP3），可能在白细胞募集中发挥作用。
图4A-D 心血管特征和疾病病因SMC表型特征
5.病原性 SMC 和免疫表型的定义
研究定义了与疾病相关的SMC和免疫表型，使用LDSC-SEG和MAGMA分析发现纤维肌细胞是冠心病/心肌梗死（CAD/MI）特征中最富集的SMC表型，而纤维软骨细胞（FCs）则在冠状动脉钙化（CAC）中高度富集（图4D）。虽然不显著，但观察到泡沫样SMC和收缩型SMC分别在CAD和CAC中的富集趋势。通过单细胞分辨率的GWAS特征富集估计，结果验证了一级注释的发现，并优先考虑了促炎性巨噬细胞和泡沫巨噬细胞在白细胞计数和阿尔茨海默病中的作用（图4E）。此外，分析显示纤维肌细胞和泡沫样SMC在CAD中的权重略高于其他SMC簇，并揭示了内皮细胞（ECs）和泡沫巨噬细胞在CAD中的富集，其中内膜ECs和内皮-间充质转化（EndoMT）ECs略高于促炎性ECs。
图4E 心血管特征和疾病病因SMC表型特征
6.人类动脉粥样硬化中的细胞串扰
研究者利用CellChat工具分析了动脉粥样硬化中细胞间的串扰，特别是针对1级和2级注释的细胞类型在病变状态不同的情况下的细胞间通讯。在非病变样本中，平滑肌细胞(SMCs)与成纤维细胞之间的相互作用较强，而在病变样本中，SMCs与内皮细胞(ECs)、巨噬细胞和T/NK细胞之间的相互作用更为显著（图5A）。通过比较SMCs和巨噬细胞之间的信号通路富集分析，研究者们揭示了在非病变样本中TNFα和血小板衍生生长因子信号通路的富集，而在病变样本中，类似肿瘤坏死因子的弱诱导凋亡因子(TWEAK)和骨桥蛋白(SPP1)介导的信号通路得到了富集（图5B）。SPP1信号特别针对SMCs，主要由巨噬细胞泡沫细胞簇驱动（图5C），这与之前的研究一致，这些信号在髓系-SMC介导的血管炎症和钙化中起作用。利用SMC亚型注释，研究者观察到在病变样本中，收缩性/过渡性SMCs与不同的髓系亚型之间有更多的TWEAK介导的相互作用。相反，来自泡沫状巨噬细胞的SPP1信号特别针对收缩性和过渡性SMCs（图5D）。
图5A-D 人类动脉粥样硬化中的细胞串扰
通过配体-受体相互作用分析，研究者们还发现，表达SPP1配体的髓系基因优先通过异二聚体ITGA8/ITGB1受体向纤维肌细胞和泡沫样SMCs发出信号（图5E）。
图5E 人类动脉粥样硬化中的细胞串扰
7.SMC基因拟时序表达模型的建立
研究利用Monocle 3对SMC基因表达进行了伪时间分析，将收缩型SMC作为起点，探究了转变型SMC朝向纤维肌细胞或FC转变的过程（图6A）。结果显示在伪时间的不同阶段，纤维肌细胞和FC标记基因的表达呈现不同的动态变化。早期伪时间阶段，一些纤维肌细胞标记基因（如FN1、AEBP1和LTBP1）以及先锋标记基因LGALS3的表达逐渐增加，而其他基因如PDGFRB则在后期才开始活跃（图6B），这可能暗示了它们在SMC向纤维肌细胞转变的过程中的作用。同时，在FC标记基因和模块9的基因中，COL1A2和MMP2等基因的表达逐渐增加，而IBSP、CRTAC1和COMP等基因则在后期增加，这可能表明转变型SMC朝向FC转变的动态过程（图6C）。
随后利用VIPER和DoRothEA人类调控子数据库来推断驱动细胞特异性表达变化的上游转录因子。这项分析证实了已知的纤维肌细胞和纤维软骨细胞的调控因子，如TCF21和SOX9（图6D）。
图6A-E 富含ECM的SMC表型其伪时间和TF推断
8.CRTAC1 和 LTBP1 作为人体动脉粥样硬化中 FC 和纤维肌细胞的候选标记物
研究者识别了CRTAC1和LTBP1作为人类动脉粥样硬化中纤维软骨细胞和纤维肌细胞的潜在标记物。CRTAC1在纤维软骨细胞（FCs）中的表达显著高于其他平滑肌细胞（SMC）簇，而LTBP1在TGF-beta的分泌和激活中起着关键作用，这可能与SMC的调节及斑块稳定性有关。
通过GTEx数据库分析确认了这些基因在动脉组织中的富集表达，并观察到CRTAC1在晚期冠状动脉病变中的上调以及LTBP1的下调（图7D）。此外，使用STARNET基因调控网络分析发现CRTAC1与其共表达模块中的CAD基因、C反应蛋白和LDL胆固醇高度相关（图7E）。
最后通过免疫染色和原位杂交技术在人类冠状动脉中验证了这些标记物的蛋白定位（图7F、G）。
图7D-G CRTAC1和LTBP1是动脉粥样硬化进展的候选标志物
文章小结
这篇文章通过综合单细胞荟萃分析，构建了一个包含118,578个细胞的全面人类动脉粥样硬化图谱，揭示了血管细胞状态的异质性和遗传贡献。通过整合基因组关联研究(GWAS)数据，发现了平滑肌细胞(SMC)表型在冠状动脉疾病(CAD)、心肌梗死和冠状动脉钙化中的关键作用，并识别了LTBP1和CRTAC1作为调节SMCs和动脉粥样硬化进展的标记物。此外，研究还涉及了细胞间通讯分析、转录因子活性推断，并通过实验验证了这些标记物在人类冠状动脉组织中的表达。（看到这不知道小伙伴们对这个思路有没有想法呢，无需自测数据，只需功能验证，换个方向即可复现。如果有兴趣的话欢迎扫码来找小记者做设计哦~~）
参考文献doi：10.1016/j.celrep.2023.113380
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