杨梅属常绿乔木，杨梅果实富含多种人体必需的营养元素，具有生津止渴，健脾开胃之功效，有很高的药用和经济价值，在我国南方广泛种植。但是近些年很多杨梅主产区陆续出现一种新的病害，且在部分区域成为难以防治的主要病害，其表现症状为：春季和秋季发出新梢时叶片尖、狭窄、畸形、弯曲且多为侧弯、皱缩、沿叶脉褪绿、叶片短小等症状。该病害严重影响杨梅的生长发育，降低杨梅果实的品质。种植者尝试使用防控真菌病害、细菌病害、病毒病等所有的药物，都不见效果，并且在全世界也找不到该病害的描述、研究文献以及防治技术。
为攻克杨梅病的这个难题，从2019年开始，云南农业大学何月秋教授安排几名博士和硕士研究生进行科技公关。经过多年的研究，终于在2023年年初将研究文章发表在国际知名期刊----奥地利的《病毒学档案》。科学家们从叶片中分离出一株新的citlodavirus病毒，经过鉴定属于双生病毒的柑橘褪绿矮缩病毒。由于双生病毒是防治难度特别大的病毒病害，因此种植者使用以增强作物抵抗力防控病毒病机理的产品，几乎无效，所以本研究将有助于杨梅产业的健康发展。
中文首发：
《从云南杨梅叶片上分离出一种新的Citlodavirus的完整基因组序列》
高丽珂· Rex Frimpong Anane ·陈泽历·何月秋·李尚贇·字绍美·杨泽芬·初必帆·文国松·赵明富
（云南农业大学）
摘要：
通过高通量测序，从表现为叶尖窄小畸形、皱缩和沿叶脉褪绿的杨梅叶中分离到一种新的citlodavirus病毒，暂命名为MRV1（Myrica rubra citlodavirus 1；登录号：OP374189），并对其全基因组序列进行了测定和分析。MRV1是一种单链环状无包膜的DNA病毒，基因组大小为3776个核苷酸，包含六个开放阅读框（ORFs），其基因组正义编码一个外壳蛋白（CP，nt：381-1,124，247aa）、两个假设运动蛋白（V3，nt：13-297，94aa)、(V2，nt：92-526，144aa）、一个运动蛋白(MP，nt：1,158-2,069，303aa）；反义编码两个复制蛋白（Rep，nt：2,498-2,184，194aa）和（RepA，nt：3,343-2,465，292aa）。Citlodavirus基因组结构在长基因组间隔区（LIR）含有高度保守的 5′-TAATATTAC-3′ 茎环基序。全基因组序列比对分析表明，MRV1与西番莲褪绿斑驳病毒（PCMoV，登录号：MG696802）的核苷酸序列相似性最高，为26.7%。系统发育分析表明，MRV1与茶树褪绿矮缩相关病毒（CaCDaV，登录号：MG452759）相似性最高，并于citlodaviruses单独聚为一个分支。结合序列比对和系统发育分析，建议将MRV1列为双生病毒科Geminiviridae、Citlodavirus的一个新成员。
关键词：杨梅、高通量测序、Citlodavirus
介绍：
杨梅（Myrica rubra ）属于杨梅科杨梅属常绿乔木，杨梅果实富含多种人体必需的营养元素，具有生津止渴，健脾开胃之功效，有很高的药用和经济价值，在我国南方广泛种植[1]。目前由于杨梅大面积种植，病害防治技术不到位，使杨梅病害普遍发生，导致杨梅产量和质量下降，进而阻碍杨梅产业的发展[2]。在杨梅上已经报道过的病害多为真菌性和细菌性病害，可造成果实腐烂、枝条枯死、叶片枯死甚至树木死亡[3]。据报道，在杨梅病枝中分离出拟青霉，在拟青霉中检测到8种真菌病毒[4]。但目前未见关于杨梅植物病毒病的报道。
双生病毒科的病毒是一种单链环状无包膜的DNA病毒，病毒粒子呈孪生不完全二十面体（T=1），含22×38 nm单一外壳蛋白。基因组为单组份或双组份结构，大小为2.5-5.2kb[5]。双生病毒科的成员可以侵染单子叶和双子叶植物，且通常以叶蝉、树蝉、蚜虫和粉虱等昆虫介体以持久性方式传播。双生病毒是一种重要的植物病原体，在热带和亚热带地区引起重要的经济疾病，并对全球各种农作物构成威胁[6-8]。截止2020年已在双生病毒科内建立了9个属，分别为Becurtovirus、Begomovirus、Capulavirus、Curtovirus、Eragrovirus、Grablovirus、Mastrevirus、Topocuvirus、Turncurtovirus。在过去的十年中，又在双生病毒科建立了五个新属，分别是Citlodavirus、Maldovirus、Mulcrilevirus、Opunvirus、Topilevirus[9]。Citlodavirus属成员的基因组为单组份结构，最显著的特征是它们的基因组比其他已知的单倍体双生病毒的基因组大12%-30%。该属成员基因组结构在长基因组间隔区（LTR）含有高度保守的 5′-TAATATTAC-3′ 茎环基序。基因组包含六个开放阅读框，基因组正义编码外壳蛋白（CP）、运动蛋白（MP）和另外两种假设的小蛋白V2和V3；反义编码RepA和Rep蛋白。目前已报道的该属病毒有柑橘褪绿矮缩相关病毒（CCDaV，登录号：JQ920490）、茶树褪绿矮缩相关病毒（CaCDaV，登录号：MG452759）、西番莲果实褪绿斑驳病毒（PCMoV，登录号：MG696802）和纸桑卷叶病毒2号（PMLCV-2，登录号：MN595127）[10-13]。
杨梅因其药用价值和经济价值被广泛种植。然而，到目前为止，还没有与叶尖窄小畸形、皱缩和沿叶脉褪绿这些症状相关的病毒基因组的报道。在本研究中，通过高通量测序，从杨梅病状叶片中分离到一种新的citlodavirus病毒，并对其与其它已知病毒的分类和系统发育关系进行了讨论。
2、材料与方法
2.1样品采集
2020年9月在云南省石屏县采集疑似病毒病症状的杨梅叶片，叶片症状表现为叶尖窄小畸形、皱缩和沿叶脉褪绿，将叶片剪成小片放置于自封袋中并做好标记，保存在-80℃（如图1A所示）。
图1：MRV1的基因组结构。（A）表现为叶尖窄小畸形、皱缩和沿叶脉褪绿症状的杨梅叶片。（B）MRV1基因组结构图和六个预测的开放阅读框。不同颜色的箭头代表ORF，标明了各个蛋白质的名称。数字表示定义每个ORF起始密码子和终止密码子的核苷酸位置。LIR表示长基因间隔区。
2.2 高通量测序
将病叶样本送往OeBiotech有限公司（中国上海），在Illumina HiSeq-2500平台上进行高通量测序（HTS），获得病毒基因组全序列。
2.3 DNA提取
使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型、BioTeKe）提取杨梅叶片基因组DNA，并保存于-80℃。
2.4 PCR扩增
为了验证病状样本中病毒是否存在，我们根据组装的病毒重叠群序列设计特异性引物（附表S1所示）。采用2×Taq PCR MasterMix (Biomed, Beijing)进行聚合酶链式反应（PCR），三对特异性引物（MP1、MP2、CP），反应总体积25 μL（DNA模板2 μL，引物F/R各1 μL，ddH2O 8.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL）。反应程序为94℃预变性3min；30个循环：94℃ 30s、退火温度56℃/57.4℃ 30s、72℃ 30s；72℃继续延伸5min；4℃保存。使用浓度为1.2%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测，选择符合目的条带的PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
2.5 序列和系统发育分析
通过使用NCBI ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）对病毒基因组序列的开放阅读框（ORF）进行预测，使用CDD预测各个蛋白质的保守结构域。为了验证ORF的准确性，从NCBI数据库中检索相关病毒和主要蛋白的核苷酸（nt），在BioEdit 7.0程序中使用ClustalW 算法比较序列的相似性。使用MEGA7.0确立新病毒与相关病毒之间的系统发育关系。
结果
对高通量测序结果进行分析，共获得23,879,136对原始读数，对原始数据进行处理后得到23,279,542个清洁读数，从头组装共产生了28,563个重叠群。然后在NCBI中对这些重叠群进行BLAST分析，获得一个由3776个核苷酸组成的重叠群与双生病毒科Geminiviridae、Citlodavirus属的病毒基因组序列相似性最高。MRV1的完整DNA基因组由3776个核苷酸组成，呈环状结构，包含6个ORFs和一个基因间隔区（长基因间隔区LIR），在长基因组间隔区（LIR）含有高度保守的 5′-TAATATTAC-3′ 茎环基序[14]（如图1B所示）。ORF1编码一个假想运动蛋白（V3，nt：13-297，94aa，约10.4kDa），ORF2编码一个假想运动蛋白（V2，nt：92-526，144aa，约16.7 KDa），与ORF1部分重叠，均起始于ATG密码子。ORF3编码一个外壳蛋白（CP，nt：381-1,124，247aa，约27.9 KDa），具有ATG和TAA起始和终止密码子。双生病毒外壳蛋白包含核输出因子家族BR1（Pfam00844），单链和双链DNA的核外移动是由BR1蛋白介导的[15]，参与了病毒DNA的核运输和囊化，从而可能在细胞内和细胞间的运动以及全身感染中发挥作用[16]。ORF4编码一个运动蛋白（MP，nt：1,158-2,069，303aa，约33.5KDa），含有BL1（Pfam00845）保守域结构蛋白，与发育中的韧皮部细胞内质网衍生的小管相关[17]。ORF5编码复制相关蛋白RepA（nt：3,343-2,465，292aa，约34 KDa)，位于互补正义链两个有重叠的ORF中的第一个。RepA包含一个催化结构域结构蛋白AL1（Pfam00799）和一个中心结构域蛋白AL1 M（Pfam08283），AL1蛋白编码是双生病毒的复制起始蛋白，它是一种复制子特异性起始酶，是复制体的重要组成部分[18]。ORF6编码一个复制蛋白Rep（nt：2498-2184，194aa，约12.1KDa）。
通过对MRV1全基因组和各个ORF核苷酸序列比对分析表明，MRV1与Citlodavirus属成员有24.6%-26.7%的全基因组核苷酸序列相似性范围，与PCMoV的相似性最高为26.7%。其中与CaCDaV-Ca1 CP相似性最高为30.6%（如表1所示）。为了确定MRV1的系统发育地位以及与双生病毒科其它病毒之间的进化关系，利用CP蛋白的氨基酸序列构建了系统发育树。系统发育树结果表明（如图2所示），MRV1与citlodaviruses成员聚在一起，与CaCDaV同源关系最近，并于这个citlodaviruses成员聚为单独的一个小分支。结合ICTV Citlodavirus的物种划分标准：全长核苷酸序列同源性小于78%的物种为一个新种，MRV1应被视为该属的一个新成员。
表1：MRV1与Geminiviridae科成员全长以及主要蛋白的核苷酸（nt）序列相似性
Genus
|
Virus
|
Genome sizes (nt)
|
Sequence identity (%)
|
V3
|
V2
|
CP
|
MP
|
RepA
|
Rep
|
Citlodavirus
|
CCDaV1
|
3641
|
26.1
|
-
|
33.7
|
28.3
|
26.7
|
24.5
|
53.1
|
CCDaV2
|
3642
|
26.1
|
-
|
33.7
|
28.3
|
26.7
|
24.5
|
53.1
|
|
CCDaV3
|
3642
|
25.2
|
-
|
33.7
|
28.3
|
26.9
|
24.5
|
53.1
|
|
CaCDaV-HZ1
|
3696
|
25.1
|
29.4
|
29.8
|
30.1
|
23.0
|
29.1
|
54.3
|
|
CaCDaV-Ca1
|
3687
|
25.2
|
22.6
|
30.1
|
30.6
|
23.1
|
28.1
|
52.8
|
|
PCMoV
|
3743
|
26.7
|
25.6
|
22.2
|
29.9
|
27.1
|
31.9
|
26.7
|
|
PMLCV-2-TL
|
3757
|
25.6
|
24.5
|
24.1
|
27.2
|
24.4
|
28.2
|
53.33
|
|
PMLCV-2-SWU
|
3763
|
24.6
|
23.5
|
23.9
|
26.4
|
24.5
|
30.0
|
50.8
|
|
PMLCV-2-HY
|
3756
|
25.0
|
24.5
|
23.6
|
27.6
|
24.2
|
26.0
|
54.6
|
|
Becurtovirus
|
BCTLV
|
2845
|
18.9
|
-
|
17.4
|
30.2
|
-
|
27.2
|
27.3
|
Begomovirus
|
AEV
|
2746
|
18.9
|
-
|
-
|
26.3
|
-
|
-
|
8.1
|
Capulavirus
|
ALCV
|
2745
|
19.3
|
26.1
|
30.6
|
25.8
|
-
|
25.7
|
-
|
Curtovirus
|
BCTV
|
2955
|
20.8
|
-
|
-
|
28.2
|
9.7
|
-
|
7.2
|
Eragrovirus
|
ECSV
|
2754
|
18.0
|
-
|
18.1
|
26.6
|
-
|
-
|
8.3
|
Grablovirus
|
GRBV
|
3206
|
22.2
|
-
|
21.7
|
26.6
|
-
|
24.0
|
21.1
|
Maldovirus
|
AGV1
|
2932
|
19.8
|
-
|
20.0
|
28.1
|
-
|
-
|
8.6
|
Mastrevirus
|
ACSV
|
2858
|
19.4
|
24.5
|
-
|
25.7
|
-
|
30.4
|
22.6
|
Mulcrilevirus
|
MCLV
|
2952
|
18.1
|
24.2
|
32.8
|
43.1
|
-
|
23.0
|
43.6
|
Opunvirus
|
OpV1
|
2945
|
20.5
|
-
|
17.2
|
27.6
|
-
|
-
|
9.9
|
Topilevirus
|
ToALCV
|
2847
|
19.1
|
-
|
23.9
|
26.7
|
-
|
24.1
|
23.3
|
Topocuvirus
|
TPCTV
|
2861
|
20.5
|
-
|
18.8
|
25.4
|
-
|
-
|
8.7
|
Turncurtovirus
|
SeCTV
|
2964
|
20.5
|
-
|
22.0
|
27.5
|
-
|
-
|
7.7
|
图2：利用MRV1 与Geminiviridae其它22种成员的CP氨基酸序列构建系统发育树。该树是使用MEGA 7.0，采用邻接法构建，有1000个自举重复。不同属的成员用括号表示。左下角的标尺对应的遗传距离为0.20。
讨论：
在本研究中，通过HTS我们在杨梅叶中获得一个完整的病毒基因组序列，暂命名为MRV1。多重序列比对分析表明，MRV1与citlodaviruses成员的核苷酸序列相似性范围为24.6%-26.7%。根据Citlodavirus属成员物种划分标准确定MRV1为该属的一个新成员。Citlodaviruses成员有一个有限的自然寄主范围，为有症状的双子叶树和灌木。从中国、泰国和土耳其的柑橘、日本茶花和中国山茶、巴西的西番莲和中国的构树上均分离到citlodaviruses，造成了严重的经济损失。Citlodavirus属为近年来划分的一个新属，由于植物病毒病专化性强、危害大、较难防治[19]，目前针对citlodaviruses的防治技术还不成熟。此外，双生病毒科成员通过昆虫介体以持久性方式传播，但在杨梅病叶上未见有明显的昆虫叮咬，还需要进一步研究来确定主要传播媒介。这是citlodavirus首次侵染杨梅的报道，为杨梅病毒性病害防控提供理论基础。
参考文献
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Table S1. Primers used in this study
Primer
|
Sequence（5′-3′）
|
Tm/℃
|
MP1-F
|
TACCTGCGAATTGCTCTGGA
|
56℃
|
MP1-R
|
GAAGACCTTGGCGTGCGTA
|
|
MP2-F
|
CGGTCTTACCGCTTACTGCT
|
57.4℃
|
MP2-R
|
ACCTTGGCGTGCGTACTATC
|
|
CP-F
|
CCTGAAGTCTTTACCGCCAT
|
56℃
|
CP-R
|
GCACCTGGAGAAAGAGAAGA
|
杨梅病毒病防控效果
为攻克杨梅病毒病的难题，经云南省石屏县有关部门邀请，由安徽省国壬生物科技有限公司承担本实验项目。
一、正在发病的叶片
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