前言
饲料为动物生长发育所必需的营养物质来源，其质量及合理配比等直接关系动物的健康。
植物性饲料是畜禽饲料中来源最丰富、用量最多的饲料，其中包括豆粕和葵饼等。
含硫氨基酸具有促进营养物质在肠道消化吸收和代谢，维持肠道正常形态结构，增强肠道紧密连接蛋白通透性、肠道机械屏障和生物学屏障等功能，在动物生长发育及机体免疫方面发挥着重要作用。
饲料中的含硫氨基酸包含蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定饲料中含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）的含量。
实验方案
01
色谱条件
K2025高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；
色谱柱：C18色谱柱，4.6×250 mm，5 μm或者相当的色谱柱；
流动相：以80%乙腈水溶液为流动相A，乙酸钠缓冲液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
|
时间(min) |
流速(mL/min) |
A(%) |
B(%) |
|
0.0 |
1.000 |
3.0 |
97.0 |
|
10.0 |
1.000 |
5.0 |
95.0 |
|
14.0 |
1.000 |
15.0 |
85.0 |
|
29.0 |
1.000 |
34.0 |
66.0 |
|
30.0 |
1.000 |
100.0 |
0.0 |
|
37.0 |
1.000 |
100.0 |
0.0 |
|
37.1 |
1.000 |
3.0 |
97.0 |
|
45.0 |
1.000 |
3.0 |
97.0 |
进样量：10 μL；
柱温：40℃；
检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为254 nm。
实验结果
02
重复性测试
按照色谱条件进行采集，混合标准溶液（磺基丙氨酸和蛋氨酸砜浓度分别为18.668 µg/mL和20.380 µg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。
图1 混合标准溶液的色谱图
表1 混合标准溶液积分结果
|
目标物 |
磺基丙氨酸 |
蛋氨酸砜 |
|
保留时间（min） |
6.933 |
21.250 |
|
峰面积（mAU.s） |
100.245 |
367.902 |
|
峰高(mAU) |
11.689 |
52.231 |
|
理论塔板数 |
15275 |
245479 |
|
分离度 |
- |
72.33 |
|
对称/拖尾因子 |
0.99 |
0.87 |
由表1中数据可知，磺基丙氨酸的理论塔板数为15275，拖尾因子为0.99；蛋氨酸砜的理论塔板数为245479，拖尾因子为0.87，均具有良好的峰形。
将混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。
图2 混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图
表2 混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计
|
目标物 |
磺基丙氨酸 |
蛋氨酸砜 |
||
|
项目 |
保留时间 (min) |
峰面积 (mAU.s) |
保留时间 (min) |
峰面积 (mAU.s) |
|
1 |
6.908 |
98.987 |
21.242 |
358.595 |
|
2 |
6.967 |
98.840 |
21.267 |
357.665 |
|
3 |
6.933 |
100.251 |
21.250 |
358.720 |
|
4 |
6.908 |
99.681 |
21.242 |
357.779 |
|
5 |
6.933 |
99.533 |
21.242 |
356.339 |
|
6 |
6.933 |
100.057 |
21.250 |
359.915 |
|
7 |
6.917 |
99.119 |
21.258 |
354.052 |
|
平均值 |
6.928 |
99.495 |
21.250 |
357.581 |
|
RSD% |
0.296 |
0.543 |
0.045 |
0.533 |
由表2中数据可知，混合标准溶液连续进样7针，磺基丙氨酸保留时间的RSD为0.296%，峰面积的RSD为0.543%；蛋氨酸砜保留时间的RSD为0.045%，峰面积的RSD为0.533%，均具有良好的定性定量重复性。
含量测定
校准曲线
将衍生后的混合标准系列工作液在HPLC上进行测定，叠加色谱图见图3。磺基丙氨酸和蛋氨酸砜在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2均大于0.999，线性关系均良好。
图3 混合标准系列工作液叠加的色谱图
含量测定
将饲料试样（豆粕）按照流程进行处理，计算试样中含硫氨基酸的含量。
空白试液的色谱图、试样的色谱图及试样加标的色谱图如图4~图6所示，试样中含硫氨基酸的含量见表3。
图4 空白试液的色谱图
图5 豆粕试样的色谱图
图6 豆粕试样加标的色谱图
表3 豆粕试样中含硫氨基酸含量结果表
|
目标物 |
胱氨酸含量(%) |
蛋氨酸含量(%) |
|
平行样品1含量 （%） |
0.60 |
0.63 |
|
平行样品2含量 （%） |
0.59 |
0.66 |
|
含量均值 （%） |
0.59 |
0.65 |
|
平行样间偏差 （%） |
0.89 |
1.93 |
|
回收率 （%） |
93.7 |
99.0 |
由表3中数据可知，豆粕试样中胱氨酸的含量为0.59%，平行样间的偏差为0.89%；蛋氨酸的含量为0.65%，平行样间的偏差为1.93%，均满足《GB/T 15399-2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法》中在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算数平均值的差值，当含量大于0.5%时，不超过4%的要求；胱氨酸和蛋氨酸的加标回收率分别为93.7%和99.0%。
结论
03
实验结果表明：
磺基丙氨酸的理论塔板数为15275，拖尾因子为0.99；蛋氨酸砜的理论塔板数为245479，拖尾因子为0.87，均具有良好的峰形；
混合标准溶液连续进样7针，磺基丙氨酸保留时间的RSD为0.296%，峰面积的RSD为0.543%；蛋氨酸砜保留时间的RSD为0.045%，峰面积的RSD为0.533%，均具有良好的定性定量重复性；
磺基丙氨酸和蛋氨酸砜在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2均大于0.999，线性关系均良好；
饲料试样测试中，豆粕试样中胱氨酸和蛋氨酸的含量分别为0.59%和0.65%，平行样间的偏差分别为0.89%和1.93%，均满足《GB/T 15399-2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法》中在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算数平均值的差值，当含量大于0.5%时，不超过4%的要求；
加标回收实验中，胱氨酸的回收率为93.7%，蛋氨酸的回收率为99.0%。
因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可用于饲料中含硫氨基酸的含量测定。
