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K2025高效液相色谱仪：

K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

色谱柱：C₁₈色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

流动相：A：6.8g磷酸二氢钾，用水溶解并定容至1L，用磷酸调pH至2.5~2.8；B：100%甲醇。按A:B=98:2混合，过0.45μm滤膜，超声脱气。

流速：0.7 mL/min；

进样量：20 μL；

柱温：25 ℃；

检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为245nm。

按照上述色谱条件进行采集，抗坏血酸混合标准工作液（浓度均为1.0μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

图1 抗坏血酸混合标准溶液的色谱图

表1 抗坏血酸混合标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，L(+)-抗坏血酸的理论塔板数为10816，D(-)-抗坏血酸的理论塔板数为11070，L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的分离度为1.83，可实现基线分离。

将抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

图2 抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2 抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计

将混合标准溶液连续进样7针进行重复性测试，L(+)-抗坏血酸保留时间的RSD为0.203%，峰面积的RSD为0.501%；D(-)-抗坏血酸保留时间的RSD为0.222%，峰面积的RSD为0.300%。均具有良好的定性定量重复性。

按照色谱条件将抗坏血酸标准系列工作液上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图3—图4所示。

图3 L(+)-抗坏血酸的校准曲线

图4 D(-)-抗坏血酸的校准曲线

由图3—图4可知，L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R²均在0.999以上。

抗坏血酸系列标准工作液叠加的色谱图如图5所示。

图5 抗坏血酸系列标准工作液叠加的色谱图

试样溶液的测定

以乳粉作为试样，按流程对其进行处理，并进行加标回收实验。

通过对抗坏血酸的分离度、重复性、灵敏度、线性的测试以及对乳粉试样中抗坏血酸的含量及加标进行测定，实验结果表明：

L(+)-抗坏血酸的理论塔板数为10816，D(-)-抗坏血酸的理论塔板数为11070，L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸的分离度为1.83，可实现良好的分离；

重复性测试中，抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针，L(+)-抗坏血酸保留时间的RSD为0.203%，峰面积的RSD为0.501%；D(-)-抗坏血酸保留时间的RSD为0.222%，峰面积的RSD为0.300%，均具有良好的定性定量重复性；

L(+)-抗坏血酸的仪器检出限为0.015μg/mL，仪器定量限为0.049μg/mL；D(-)-抗坏血酸的仪器检出限为0.017μg/mL，仪器定量限为0.056μg/mL；L(+)-抗坏血酸和D(-)-抗坏血酸在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R²均在0.999以上；

对乳粉试样进行测定，L(+)-抗坏血酸的含量为0.610mg/g，D(-)-抗坏血酸未检出，L(+)-抗坏血酸总量为59mg/100g，抗坏血酸的加标回收率范围为75.2%~81.2%。

因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《GB 5009.86-2016 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定（第一法）》乳粉中抗坏血酸含量测定的需求。