前言
珍珠奶茶里的珍珠、芋圆仙草的芋圆......这些甜品小食广受欢迎，你知道它们是由什么制作而成的吗? 其实，它们都来源于同一种原料一一木薯。
木薯别名为树葛，大戟科木薯属植物，被称为“淀粉之王”。木薯叶中不仅含有丰富的类胡萝卜素，黄酮类物质含量也很高。黄酮类化合物具有清除自由基、增强抗氧化活力的作用。
本文使用K2025高效液相色谱仪测定木薯叶中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷4种黄酮醇化合物的含量。
K2025高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；
色谱柱： C18色谱柱，4.6×250 mm，5 μm或者相当的色谱柱；
流动相：以甲醇为流动相A，0.2%磷酸水溶液为流动相B；按下表进行梯度洗脱：
|
时间/min |
A% |
B% |
|
0 |
25 |
75 |
|
15 |
58 |
42 |
|
20 |
80 |
20 |
|
25 |
100 |
0 |
|
27 |
25 |
75 |
|
32 |
25 |
75 |
流速：0.8 mL/min；
进样量：10 μL；
柱温：40℃；
检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为360 nm。
按照色谱条件进行采集，混合标准溶液（杨梅苷浓度为2.75 μg/mL、芦丁浓度为14.50 μg/mL、烟花苷浓度为8.75 μg/mL、水仙苷浓度为2.75 μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。
图1 混合标准溶液的色谱图
表1 混合标准溶液色谱图积分结果
目标物 |
保留时间 (min) |
峰面积 (mAU.s) |
峰高 (mAU) |
理论塔板数 |
分离度 |
对称/拖尾因子 |
|
杨梅苷 |
17.008 |
84.012 |
8.584 |
71176 |
- |
1.14 |
|
芦丁 |
17.667 |
524.308 |
54.113 |
77767 |
2.59 |
1.12 |
|
烟花苷 |
19.700 |
211.810 |
21.675 |
93182 |
7.95 |
1.12 |
|
水仙苷 |
20.075 |
102.935 |
9.524 |
82282 |
1.40 |
0.94 |
由表1中数据可知，杨梅苷的理论塔板数为71176，拖尾因子为1.14；芦丁的理论塔板数为77767，拖尾因子为1.12；烟花苷的理论塔板数为93182，拖尾因子为1.12；水仙苷的理论塔板数为82282，拖尾因子为0.94，皆具有良好的峰形。
将混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。
图2 混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图
表2 混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计
|
目标物 |
杨梅苷 |
芦丁 |
烟花苷 |
水仙苷 |
||||
|
|
保留 时间 (min) |
峰面积 (mAU.s) |
保留 时间 (min) |
峰面积 (mAU.s) |
保留 时间 (min) |
峰面积 (mAU.s) |
保留 时间 (min) |
峰面积 (mAU.s) |
|
1 |
17.008 |
83.085 |
17.667 |
524.308 |
19.700 |
211.810 |
20.075 |
102.935 |
|
2 |
17.025 |
83.064 |
17.683 |
523.873 |
19.725 |
211.811 |
20.100 |
102.845 |
|
3 |
17.017 |
82.66 |
17.675 |
523.411 |
19.717 |
211.548 |
20.092 |
103.342 |
|
4 |
17.033 |
82.937 |
17.692 |
522.850 |
19.725 |
211.312 |
20.100 |
102.807 |
|
5 |
17.042 |
82.351 |
17.700 |
522.676 |
19.733 |
211.645 |
20.108 |
103.247 |
|
6 |
17.042 |
82.052 |
17.700 |
521.659 |
19.742 |
211.018 |
20.117 |
102.377 |
|
7 |
17.058 |
81.671 |
17.717 |
517.186 |
19.758 |
209.204 |
20.133 |
101.715 |
|
平均值 |
17.032 |
82.546 |
17.691 |
522.280 |
19.729 |
211.193 |
20.104 |
102.753 |
|
RSD% |
0.100 |
0.658 |
0.096 |
0.461 |
0.094 |
0.436 |
0.092 |
0.541 |
由表2中数据可知，混合标准溶液连续进样7针重复性测试，杨梅苷保留时间的RSD为0.100%，峰面积的RSD为0.658%；芦丁保留时间的RSD为0.096%，峰面积的RSD为0.461%；烟花苷保留时间的RSD为0.094%，峰面积的RSD为0.436%；水仙苷保留时间的RSD为0.092%，峰面积的RSD为0.541%，皆具有良好的定性定量重复性。
按照色谱条件进行采集，将黄酮醇系列混合标准工作液上机测定，杨梅苷、芦丁、烟花苷及水仙苷在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2在0.999以上。黄酮醇系列混合标准工作液叠加的色谱图如图3所示。
图3 黄酮醇系列混合标准工作液叠加色谱图
空白溶液的色谱图、木薯叶平行试样1、木薯叶平行试样2的色谱图如图4~图6所示。
图4 空白溶液的色谱图
图5 木薯叶平行试样1的色谱图
图6 木薯叶平行试样2的色谱图
计算木薯试样中黄酮醇的含量，两次平行测试中，杨梅苷的含量分别为4.4 mg/kg、3.8 mg/kg，相对偏差为7.50%；芦丁的含量分别为9.8×103 mg/kg、8.7×103 mg/kg，相对偏差为5.75%；烟花苷的含量分别为7.2×103 mg/kg、6.4×103 mg/kg，相对偏差为5.79%；水仙苷的含量分别为112.1 mg/kg、120.4 mg/kg，相对偏差为3.58%，满足《GB/T 42114-2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法》中规定的两次测定结果的相对偏差不大于10%的要求。
通过对杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷的理论塔板数、重复性、线性的测试以及对木薯叶片中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷的含量进行测定，实验结果表明：
1
杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷的理论塔板数范围为71176~93182，拖尾因子范围为0.94~1.14，皆具有良好的峰形；
2
连续进样7针重复性测试，杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷保留时间的RSD范围为0.092%~0.100%，峰面积的RSD范围为0.436%~0.658%，皆具有良好的定性定量重复性；
3
杨梅苷、芦丁、烟花苷及水仙苷在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2在0.999以上；
4
两次平行测试中，杨梅苷、芦丁、烟花苷、水仙苷的相对偏差范围为3.58%~7.50%，满足《GB/T 42114-2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法》中规定的两次测定结果的相对偏差不大于10%的要求。
因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《GB/T 42114-2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法》中对木薯叶片中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷4种黄酮醇含量的测定需求。
