抑制呕吐、营养神经、促进代谢、预防血栓、治疗贫血……维生素B6的功效你了解过吗？
维生素B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。维生素B6为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。
在乳粉中，维生素B6作为营养强化剂使用。其添加量应遵循《GB 14880-2012 食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》中的要求。对于婴幼儿配方乳粉中维生素B6的添加还应遵守其对应的产品标准《GB 10765-2010 食品安全国家标准 婴儿配方食品》及《GB 10767-2010 食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品》。
检验其是否符合标准，可使用悟空K2025高效液相色谱仪测定。
01
Experiment
1
原理
样品经水提取，沉淀蛋白后，取上清液，采用液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量。
2
色谱条件
悟空K2025高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、RF-20A 荧光检测器 、K2025ATD模数转换器、Wookinglab色谱工作站；
色谱柱：C18 ，4.6×250 mm，5 μm或者相当的色谱柱；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为辛烷磺酸钠溶液，按下表进行梯度洗脱：
|
(min) |
流速 (mL/min) |
A (%) |
B (%) |
|
0.0 |
1.000 |
10.0 |
90.0 |
|
3.0 |
1.000 |
10.0 |
90.0 |
|
10.0 |
1.000 |
35.0 |
65.0 |
|
22.0 |
1.000 |
35.0 |
65.0 |
|
23.0 |
1.000 |
10.0 |
90.0 |
|
30.0 |
1.000 |
10.0 |
90.0 |
柱温：35℃；
进样量：10 μL；
检测器及波长：荧光检测器，激发波长为 293 nm，发射波长为395 nm。
02
Experiment
重复性测试
色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。
图1维生素B6标准溶液的色谱图
表1 维生素B6标准溶液色谱图积分结果
|
目标物 |
吡哆醛 |
吡哆醇 |
吡哆胺 |
|
保留时间 （min） |
11.187 |
15.915 |
20.920 |
|
峰面积 （mAU.s） |
102.393 |
617.887 |
97.286 |
|
峰高 (mAU) |
4.959 |
68.193 |
12.448 |
|
理论塔板数 |
6758 |
71697 |
168237 |
|
分离度 |
- |
12.09 |
22.67 |
|
对称/拖尾因子 |
1.06 |
1.07 |
1.12 |
由表1中数据可知，吡哆醛与吡哆醇的分离度为12.09，吡哆醇与吡哆胺的分离度为22.67，具有较好的分离度。三种物质的拖尾因子范围为1.06~1.12，均有良好的峰型。
将维生素B6标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。
图2 维生素B6溶液连续进样7针叠加的色谱图
表2维生素B6溶液连续进样7针重复性数据统计
|
目标物 |
吡哆醛 |
吡哆醇 |
吡哆胺 |
|||
|
|
保留时间 |
峰面积 |
保留时间 |
峰面积 |
保留时间 |
峰面积 |
|
1 |
11.187 |
102.393 |
15.915 |
617.887 |
20.920 |
97.286 |
|
2 |
11.173 |
102.624 |
15.908 |
620.260 |
20.900 |
97.216 |
|
3 |
11.173 |
102.272 |
15.912 |
618.631 |
20.908 |
97.314 |
|
4 |
11.168 |
102.193 |
15.903 |
618.940 |
20.888 |
98.037 |
|
5 |
11.180 |
102.411 |
15.907 |
619.105 |
20.888 |
97.824 |
|
6 |
11.162 |
102.390 |
15.905 |
620.355 |
20.893 |
97.816 |
|
7 |
11.163 |
102.484 |
15.910 |
619.127 |
20.895 |
97.624 |
|
平均值 |
11.172 |
102.395 |
15.909 |
619.168 |
20.899 |
97.588 |
|
RSD% |
0.081 |
0.136 |
0.026 |
0.141 |
0.056 |
0.328 |
由表2中数据可知，维生素B6各组分保留时间的RSD范围为0.026%~0.081%，峰面积的RSD范围为0.136%~0.328%，均具有良好的定性定量重复性。
含量测定
校准曲线
将配制好的维生素B6混合标准工作液在HPLC上进行测定叠加色谱图见图3。维生素B6各组分混合标准工作液在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2≥0.9995，线性关系均良好。
图3 维生素B6混合标准工作液浓度系列曲线叠加色谱图
样品含量测定
以市售乳粉为样品，按照流程对样品进行处理，并计算样品中维生素B6各组分的含量。样品的色谱图如图4所示。
图4 乳4粉样品的色谱图
根据计算，此乳粉样品中维生素B6的含量为10.9 mg/100 g。
03
Experiment
通过对维生素B6各组分的峰型、重复性、灵敏度、线性的测试以及对乳粉样品中维生素B6的含量进行测定，实验结果表明：
用Wooking K2025高效液相色谱仪测定维生素B6，维生素B6各组分峰分离度均大于1.5，三种物质的拖尾因子范围为1.06~1.12，具有良好的分离度及峰型；重复性测试中，将维生素B6混合标准溶液连续进样7针，维生素B6各组分的保留时间的RSD范围为0.026%~0.081%，峰面积的RSD范围为0.136%~0.328%，均有良好的定性定量重复性；维生素B6各组分的仪器检出限均小于4.819 ng/mL，仪器定量限均小于16.064 ng/mL；在测定浓度范围内，维生素B6各组分均具有良好的线性关系，确定系数R2均≥0.9995；乳粉样品中维生素B6的含量为10.9 mg/100 g。
因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《GB 5009.154-2016 食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定（第一法）》中维生素B6含量测定的需求。