HPLC-DAD
秋水仙碱为百合科植物丽江山慈菇的球茎中提取得到的一种生物碱，为类白色至淡黄色结晶性粉末，无臭，略有引湿性，遇光色变深。秋水仙碱在乙醇中易溶，在水中溶解（但在一定浓度的水溶液中能形成半水合物的结晶析出），在乙醚中极微溶解。
秋水仙碱由《中国药典（2025年版）》二部所收录，主要用于治疗急性痛风发作，通过抑制炎症反应和白细胞趋化，迅速缓解痛风所致的关节疼痛和炎症。
秋水仙碱及其有关物质在254 nm处有紫外吸收，使用反相高效液相色谱配置二极管阵列检测器进行测定。
K2025高效液相色谱仪：K2025P2二元高压输液泵、K2025AS自动进样器、K2025CO柱温箱、K2025DAD二极管阵列检测器、Wookinglab色谱工作站。
a）色谱柱：C8柱，4.6 mm×250 mm，5 μm或者相当的色谱柱；
b）流动相：以甲醇-水（55：45）为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
|
时间(min) |
A(%) |
B(%) |
|
0 |
70 |
30 |
|
35 |
70 |
30 |
|
45 |
90 |
10 |
|
80 |
90 |
10 |
注：为了系统在进样前达到平衡，每次进样前运行10 min。
c）流速：1.0 mL/min；
d）进样量：20 μL；
e）洗针液：90 %甲醇水溶液；
f）柱温：温度时间程序如下表：
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时间(min) |
柱温（℃） |
|
0 |
20 |
|
35 |
20 |
|
45 |
30 |
|
80 |
30 |
g）检测器及检测波长：检测器为二极管阵列检测器，检测波长为254 nm。
系统适用性要求：理论塔板数按秋水仙碱峰计算不低于5000，杂质Ⅰ峰（相对保留时间约为0.9）与秋水仙碱峰的分离度应符合要求；灵敏度溶液色谱图中，秋水仙碱色谱峰信噪比不小于10。
限度：供试品溶液色谱图中，杂质Ⅰ的峰面积不得大于对照溶液主峰面积的3.5倍（3.5 %），其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积（1.0 %），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的5倍（5.0 %），小于灵敏度溶液主峰面积的峰忽略不计。
（1）对照溶液色谱图
按照色谱条件进行采集，对照溶液的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。
图1 对照溶液的色谱图
表1 对照溶液色谱图积分结果
由表1中数据可知，对照溶液色谱图中，秋水仙碱的理论塔板数为11531，拖尾因子为1.01，满足《中国药典（2025年版）》二部中理论塔板数按秋水仙碱峰计算不低于5000的要求；杂质Ⅰ峰的保留时间为28.775 min，秋水仙碱峰的保留时间为31.946 min，杂质Ⅰ峰与秋水仙碱峰的相对保留时间为0.9，杂质Ⅰ峰与秋水仙碱峰的分离度为2.71，满足《中国药典（2025年版）》二部中杂质Ⅰ峰（相对保留时间约为0.9）与秋水仙碱峰的分离度应大于1.5的要求。
将对照溶液连续进样7针进行重复性测试，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。
图2 对照溶液连续进样7针叠加的色谱图
表2 对照溶液连续进样7针重复性数据统计
由表2中数据可知，对照溶液连续进样7针重复性测试中，杂质Ⅰ保留时间的RSD为0.26%，峰面积的RSD为0.60%；秋水仙碱保留时间的RSD为0.26%，峰面积的RSD为0.07%，均具有良好的定性定量重复性。
（2）光谱图
使用二极管阵列检测器对对照溶液进行光谱采集，秋水仙碱的光谱图如图3所示。
图3 秋水仙碱的光谱图
由图3可知，秋水仙碱的特征吸收波长为197 nm、245 nm和354 nm。
（3）供试品溶液色谱图
按照色谱条件进行采集，供试品溶液的色谱图如图4所示，积分结果如表3所示。
图4 供试品溶液的色谱图
表3 供试品溶液色谱图积分结果表
注：小于灵敏度溶液主峰面积的峰忽略不计。
由表3中数据可知，供试品溶液色谱图中，杂质Ⅰ的峰面积（1762.861 mAU.s）小于对照溶液主峰面积的3.5倍（3865.362 mAU.s），其他单个杂质峰面积均小于对照溶液主峰面积（1104.389 mAU.s），各杂质峰面积的和（2540.110 mAU.s）小于对照溶液主峰面积的5倍（5521.945 mAU.s），满足《中国药典（2025年版）》二部中限度的要求。
（4） 灵敏度溶液色谱图
按照色谱条件进行采集，灵敏度溶液的色谱图如图5所示，灵敏度计算结果见表4。
图5 灵敏度溶液的色谱图
表4 秋水仙碱灵敏度计算结果表
|
目标物 |
峰高 (mAU) |
噪声 (mAU) |
S/N |
|
秋水仙碱 |
1.153 |
0.008 |
144.1 |
由表4中数据可知，秋水仙碱灵敏度溶液的信噪比S/N为144.1，满足《中国药典（2025年版）》二部中灵敏度溶液色谱图中，秋水仙碱峰信噪比应不小于10的要求。
通过对供试品溶液、对照溶液、灵敏度溶液进行测定，实验结果表明：
对照溶液色谱图中，秋水仙碱的理论塔板数为11531，拖尾因子为1.01，满足《中国药典（2025年版）》二部中理论塔板数按秋水仙碱峰计算不低于5000的要求；杂质Ⅰ峰的保留时间为28.775 min，秋水仙碱峰的保留时间为31.946 min，杂质Ⅰ峰与秋水仙碱峰的相对保留时间为0.9，杂质Ⅰ峰与秋水仙碱峰的分离度为2.71，满足《中国药典（2025年版）》二部中杂质Ⅰ峰（相对保留时间约为0.9）与秋水仙碱峰的分离度应大于1.5的要求；
对照溶液连续进样7针重复性测试中，杂质Ⅰ保留时间的RSD为0.26 %，峰面积的RSD为0.60 %；秋水仙碱保留时间的RSD为0.26 %，峰面积的RSD为0.07 %，均具有良好的定性定量重复性；
秋水仙碱的特征吸收波长为197 nm、245 nm和354 nm；
供试品溶液色谱图中，杂质Ⅰ的峰面积（1762.861 mAU.s）小于对照溶液主峰面积的3.5倍（3865.362 mAU.s），其他单个杂质峰面积均小于对照溶液主峰面积（1104.389 mAU.s），各杂质峰面积的和（2540.110 mAU.s）小于对照溶液主峰面积的5倍（5521.945 mAU.s），满足《中国药典（2025年版）》二部中限度的要求；
灵敏度溶液色谱图中，秋水仙碱灵敏度溶液的信噪比S/N为144.1，满足《中国药典（2025年版）》二部中灵敏度溶液色谱图中，秋水仙碱峰信噪比应不小于10的要求。
因此，悟空 K2025高效液相色谱仪满足《中国药典（2025年版）》二部中秋水仙碱有关物质测定的需求。
本实验需启用柱温时间程序功能，以精准匹配洗脱过程中对温度动态变化的需求，保障分离效果的稳定性。
为确保进样前色谱系统（含流动相、色谱柱等）处于稳定平衡状态，需在每次进样前预先运行10 min以平衡系统。
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