mPOC之六边形战士—— KAPA3G

为了让分子床旁检测(mPOC)有效，其试剂必须能够应对特定挑战，包括在各种条件下保持可靠性、使用方便和具有成本效益的生产。实现这些目标的一个关键策略是，通过冻干等方法，配制在室温下也能保持稳定的试剂。除了室温稳定的需求之外，mPOC也对于其核心的DNA聚合酶提出了更高的要求，包括抑制剂耐受性、快速扩增、多重检测和高酶浓度。

许多分子检测中使用的酶，如DNA聚合酶和逆转录酶，传统上储存在含有甘油的缓冲液中以保持其稳定性。然而含甘油的试剂是液体，需要冷链进行储存和运输，这对于在偏远地区使用的mPOC设备来说通常是不可行的。此外，甘油会干扰制造稳定、即用型试剂颗粒或微珠所需的干燥过程。

通过使用无甘油配方且lyo-ready的试剂，制造商可以生产干燥的试剂混合物。这些干燥的试剂可以在环境温度下长时间保持稳定，无需冷藏，从而简化了物流。这还省去了单独去除甘油的步骤，简化了生产过程。

罗氏诊断提供的KAPA3G HotStart DNA聚合酶不含有甘油，可用于冻干。冻干后的KAPA3G HotStart DNA聚合酶即使在较高的储存温度下也能保持活性。如图1所示，KAPA3G HotStart DNA聚合酶冻干制剂在37°C下保存超过4个月呈现与–20°C存储的非冻干酶类似的高性能表现。

除了加速热稳定性的数据，KAPA3G HotStart DNA聚合酶冻干制剂在常温下也能保持长效的性能。冻干制剂和新鲜试剂分别在刚冻干和室温放置15个月后进行扩增，KAPA3G HotStart DNA聚合酶冻干制剂和新鲜试剂在荧光信号强度和CT值都展现了很好的一致性。这也说明冻干制剂在室温下保存一年以上酶活性几乎没有损失（图2）。

除了冻干之外，还有一些其他特性对mPOC试剂至关重要。

血液、唾液和尿液等生物样本含有可能抑制PCR反应的物质。mPOC试剂必须并能耐受这些抑制剂，以确保即使是经过最少处理的样本也能获得准确结果。

KAPA3G HotStart DNA聚合酶是KAPA定向进化的第三代DNA聚合酶，通过多种PCR抑制剂的定向筛选，使其具有强效的耐抑制性能。在样本中添加多种常见PCR抑制剂(例如醋酸钠、乙醇、肝素、EDTA等)，使用KAPA3G HotStart DNA聚合酶PCR的扩增效率均保持在90%-110%（图3）。

在床旁检测环境中，时间至关重要。为快速循环方案和高热稳定性而设计的试剂可以显著缩短获得结果的时间。

KAPA3G HotStart DNA聚合酶是继KAPA2G后罗氏诊断新推出的第三代快速热启动DNA聚合酶，依然保留了超快速扩增的优异性能，可以实现1kb/s的扩增速度。标准的PCR程序可能需要一小时或更长时间，KAPA3G这样的聚合酶可以在短短23分钟内完成整个PCR过程，并且相比其他酶Enzyme 1/Enzyme 2也有更好的检出灵敏度，Ct值显著提前并且荧光强度更高（图4）。这种时间的显著缩短是通过高速酶和优化的热循环程序相结合实现的。对于即时诊断来说，节省如此多的时间可能意味着能够迅速做出治疗决策。并且KAPA3G可以搭配耐高温的逆转录酶NxtScript 2G加速逆转录，在RT-PCR检测中的逆转录步骤会增加整个过程的时间。

为了提高诊断价值和效率，许多mPOC检测被设计为从单个样本中检测多个目标。试剂必须兼容多重检测，以实现在一个反应中同时检测多种病原体或遗传标记。

KAPA3G HotStart DNA聚合酶具有优秀的多重扩增能力。 如图5所示，KAPA3G对三个基因 EGFR(FAM), ERBB2(Hex)和 ACTB(Cy5)进行单重扩增和多重扩增，多重扩增的Ct值以及终点荧光强度均跟单重扩增的结果具有可比性。

高浓度试剂可实现更小的反应体积，这对于mPOC设备的微型化至关重要。这也有助于降低总体的检测成本。

罗氏诊断提供的KAPA3G HotStart DNA聚合酶不仅不含有甘油，其浓度更是高达30 U/μl。