DLBCL ctDNA的NGS检测方法学概览

基于血液或脑脊液技术的实用性在很大程度上依赖于足够的灵敏度和特异性来检测体液中微量的ctDNA。淋巴瘤中的cfDNA浓度变化很大——惰性滤泡性淋巴瘤 (FL) 的血浆中位数约6.5 ng/mL，原发性纵隔B细胞淋巴瘤 (PMBCL) 的约650 ng/mL，且与肿瘤分期显著相关²，因此建议至少采集10 mL血液（获取约4-6 mL 血浆）以获得足够数量的cfDNA分子用于后续分析³。实际血液中的cfDNA 总量是有限的 (一般来说10毫升血液采集管的cfDNA约4,000-8,000个基因组)，因此在血液采集量受限时最大限度地提升文库回收率至关重要【极致文库回收率请点击】。

图2: cfDNA和ctDNA水平随淋巴瘤亚型变化。图源²

A）散点图显示了不同淋巴瘤亚型中cfDNA水平的变化。

B）ctDNA水平因淋巴瘤亚型而异。

C）DLBCL来源细胞亚型之间的cfDNA和ctDNA水平均无显著差异。

D) 原代和转化FL在cfDNA和ctDNA水平上表现出显著差异。

（hGE/mL：单倍体基因组当量/mL）

目前针对DLBCL ctDNA的NGS检测方法有很多种，表1对于这些方法进行了全面的比较⁴。在DLBCL中，NGS与杂交捕获富集技术相结合，分析感兴趣的基因组区域，这种技术已得到广泛探索。CAPP-seq是这种方法学的代表，将高深度测序集中于DLBCL相关的有限基因组目标区域，追踪数十到数百个突变，这种方法具有很高的灵敏度。靶向测序还允许进行非侵入性基因分型，因此潜能巨大。虽然与基于扩增子的靶向测序相比，杂交捕获的成本更高且更复杂，但杂交捕获通常可以实现更大的基因组覆盖率、文库复杂性和检测灵敏度，尤其是在cfDNA投入量较低的情况下。罗氏基于CAPP-seq方法学设计的NGS panel已用于早前多个临床研究【Panel详情请点击】。

为了降低ctDNA检测限，通常会采用双链测序（Duplexed sequencing）的策略以要求Watson和Crick链上都发生一致序列检出（如DCS, Duplexed Consensus Sequence）。这种策略可实现低至~0.0002%的检测灵敏度⁵。然而在肿瘤负荷极低的情况下，特别是在治疗期间和治疗结束时，这一方法仍然受到灵敏度欠佳的限制。PhasED-seq是前述方法的“变形”升级，该方法涉及检测“定相变异”（PV），其中两个或多个突变发生在同一条DNA链上。通过追踪单个DNA分子同一条链上的 “定相变异”，可进一步最大限度地提高分析灵敏度并降低背景噪音⁶。

表1 DLBCL ctDNA检测方法比较。表源⁴

自ctDNA首次在DLBCL患者血浆中发现以来的数十年里，我们对这种生物标志物及其潜力的理解取得了巨大进步。随着多种ctDNA分析方法学的相继应用和分子检测技术的持续迭代，在DLBCL临床试验中使用ctDNA作为患者选择、反应适应设计和替代终点的综合生物标记物正当时！

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