mPOC之室温稳定、多维应用——AptaTaq

传统分子诊断通常需要在中心实验室进行，耗时较长，且对样本运输、储存和专业操作人员有较高要求。随着精准医疗和分级诊疗的兴起，以及对快速诊断和即时治疗决策的需求增加，分子床旁检测(mPOC)应运而生。特别是在传染病爆发期间，对快速、大规模检测的需求极大地推动了mPOC技术的发展和应用。这一应用对于核心原料——PCR扩增酶的稳定性也提出了极高的要求。

罗氏AptaTaq DNA聚合酶可谓是稳定性卓越的一位战将，这也受益于其特殊的活性封闭和热启动方式。AptaTaq DNA聚合酶通过寡核苷酸适配体进行可逆的酶失活。当温度低于+55°C时，寡核苷酸适配体与聚合酶紧密结合，抑制酶活性；当温度高于+60°C时，适配体变性，聚合酶活性完全活化(图1)。这种适配体酶修饰原理与基于抗体的修饰方法类似，但寡核苷酸适配体是人工合成的，对温度变化不敏感，从而降低了酶的污染风险，并可在室温下稳定储存。

图1. Apta Taq的封闭和热启动原理*

想要进一步助力mPOC，需要为干式制剂提供无甘油或高浓度配方原料。高浓度、不含甘油的AptaTaq DNA聚合酶保证了反应液在整个冻干过程和随后的贮存过程中的稳定性。对于新配制的预混液以及冻干制剂，在96孔板上冻干AptaTaq DNA聚合酶与PCR引物和探针，37°C下保存2、6和16周后，进行平行试验，比较AptaTaq DNA聚合酶在冻干保存后的PCR性能。反应前加入DNA模板和水后，实时荧光定量PCR测定Cp值，可以看到冻干前后Cp值基本相当，也就是酶的性能在冻干并常温保存16周后，依旧能够基本保持不变(图2)。

图2. AptaTaq DNA聚合酶冻干后37°C保存16周，

性能基本保持不变*

另外，AptaTaq DNA聚合酶的5×预混液AptaTaq Genotyping Master也是可冻干的。在96孔板上，AptaTaq Genotyping Master预混液与PCR引物和探针混合后直接干燥处理。反应前加入DNA模板和水，进行实时荧光定量PCR的基因分型检测，VIC及FAM通道检测终点荧光值。从图3可以看出无论是使用液态的新鲜制备的PCR反应液(左)还是冻干的预铺板反应物(右)，使用AptaTaq Genotyping Master进行PCR，能产生相同的结果。

图3. AptaTaq Genotyping Master液态和冻干粉终点法基因分型检测结果基本一致，均获得可靠结果*

此外，冻干的过程也是复杂且关键的。AptaTaq DNA聚合酶，即使在不加辅料的情况下冻干，其活性也不会下降。这里对不同浓度的三个基因SDHA, HPRT, GAPDH进行荧光定量PCR检测，可以看到冻干和非冻干的曲线和Cp值基本都是一致的(图4)。

图4. 简单真空干燥AptaTaq对其活性基本没有影响*

罗氏AptaTaq可冻干家族的成员还包括AptaTaq delta exo DNA聚合酶，它是N端缺失的DNA聚合酶，加以寡核苷酸适配体修饰，这种设计提高了对错配碱基的辨别，并具有宽广的动态检测范围，它可用于SNP分析和基因分型、等位基因特异性PCR以及多重PCR。另外，当您进行微生物检测或其他需要卓越灵敏度的检测时，也可以选择AptaTaq DNA聚合酶 LDx。为了更好地降低细菌、真菌和/或人类DNA污染的风险，罗氏诊断开发了这种具有非常低核酸背景的产品，最终产品通过 LightCycler®检测法分析是否存在真菌DNA、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(图5)，污染核酸的水平必须<1基因组当量/20单位DNA聚合酶，产品通过β-珠蛋白特异性LightCycler®检测法分析是否存在人类DNA污染。

图5. AptaTaq DNA 聚合酶 LDx中真菌 DNA、

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的检测*

AptaTaq庞大的家族，为mPOC的多方向应用提供了保障。同时罗氏基于大量的测试、ISO13485质量标准和批次间的一致性，确保供给工艺原料的稳定可靠性，这对于POC产品的质量控制也至关重要。