淋巴瘤NGS研究速递 | ctDNA检测助力滤泡淋巴瘤早期风险分层

滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)是一类起源于滤泡中心B细胞的非霍奇金淋巴瘤（NHL），其典型免疫表型为CD5−、CD10+、CD19+，伴t(14;18) (q32;q21)染色体易位。我国FL的发病率占B细胞NHL的8％～23％。中国滤泡淋巴瘤工作组(cwFL)专家通过分析全国多中心资料，FL诊断时中位年龄约53岁，女性发病率略高于男性，5年的无进展生存(PFS)率及总生存(OS)率分别为61％和89％¹。

FL是一种高度异质性的疾病²，其中一部分患者的预后非常差。最近的几项研究表明，治疗后的替代终点是预测总体生存率(OS)的重要指标。例如，接受一线传统免疫化疗（包括利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松，即R-CHOP）的患者中，有19%到26%的患者在24个月内病情进展（称为“早期疾病进展”，以下简称POD24），这些患者的5年OS仅为34%到50%，而没有POD24的患者5年OS为90%到94%³。而在接受新一代CD20抗体奥妥珠单抗联合化疗治疗的患者中，依然有大约10.1%的患者会经历POD244。因此，在治疗前准确识别这些早期复发风险较大的患者将有助于改善这部分患者的预后。

目前临床上较为通用的FL预后评估体系包括FLIPI (Follicular Lymphoma International Prognosis Index) -1和FLIPI-2，以及一些包含生物标志物检测结果的评估方法，例如m7-FLIPI等。然而，现有的包括FLIPI模型在分辨早期疾病进展方面的表现很难令人满意，因此临床上也在寻找新工具帮助医生更好地实现FL患者早期的疾病管理。

在美国举行第65界美国血液学会（ASH）年会上，来自罗氏的科学家们联合英国以及德国的研究者，探讨了利用下一代测序（NGS）技术，通过检测血浆循环肿瘤DNA（ctDNA），在筛选阶段识别出一线治疗中的高风险滤泡性淋巴瘤患者的可行性和有效性。该工作以《Identification of High-Risk Population in First-Line Follicular Lymphoma at Screening with a Next Generation Sequencing (NGS) Assay Using Plasma Circulating Tumor DNA (ctDNA): Initial Data from Gallium》为标题进行了墙报展示（Poster）⁵。

研究共纳入了221名参与GALLIUM研究的患者治疗前血浆ctDNA样本。GALLIUM是一项全球多中心、随机、III期临床试验。参与者被随机分为两组，分别接受奥妥珠单抗或利妥昔单抗联合化疗的治疗方案。治疗结束后，患者继续接受单药的维持治疗，直至疾病进展或出现不可接受的毒性反应。（图一）入组本次风险分析研究的患者均衡分布在GALLIUM研究的不同治疗组中。其中，50名患者接受利妥昔联合苯达莫司汀治疗，63名患者接受利妥昔联合CHOP/CVP治疗，50名患者接受奥妥珠单抗联合苯达莫司汀治疗，58名患者接受奥妥珠单抗联合CHOP/CVP治疗。根据患者的生存数据，研究者将入组患者分为高危组（high risk）和低危组（low risk），高危组患者的中位PFS时间为352天，且91.6%的患者出现POD24或出现侵袭性进展。

图1. GALLIUM研究设计：入组患者随机接受利妥昔/奥妥珠单抗联合化疗，并在治疗结束后基于疗效接受利妥昔/奥妥珠单抗至多两年的维持治疗。⁵

研究者利用基于CAPP-seq技术开发的NHL检测试剂盒检测了这些患者在治疗前的血浆样本，并根据每个样本检测到的单位血浆中的基因组单核苷酸突变（SNV）数量（mutant molecules per milliliter-of-plasma，MMPM）来计算血浆中ctDNA的含量。研究结果显示，ctDNA含量在高风险与低风险人群中区别巨大，高风险人群中的中位MMPM为276.5，而低风险组中，这个数字仅为59.9。图2A中，研究者利用最大选择秩法（maximally selected rank statistics）确定的MMPM高低水平的最佳截断值，以此将入组患者分为MMPM高人群及MMPM低人群。数据显示，无论接受何种治疗，MMPM高患者组的中位PFS都远低于MMPM低患者组（图2B）。

图2. A，高进展风险组患者的中位MMPM要远高于低进展风险组；B，高MMPM组较之低MMPM组患者有更长的中位MMPM⁵

更为关键的是，研究者还发现，ctDNA的含量是患者PFS的独立预后因子，其预后作用独立于目前已知的风险分层模型，且ctDNA分析的预后能力要远好于既有的预后模型（图3）。

图3. MMPM的风险预测模型其表现要远好于现有的FLIPI2、m7FLIPI以及SPD模型，即使用现有模型调整，MMPM也能够将高进展风险的患者识别出来⁵。

除此之外，现有的风险模型对于接受苯达莫司汀（Benda）治疗的患者预测作用不强，而以ctDNA含量作为预测工具，则能够很好的将对Benda治疗不敏感的患者识别出来（图4）。

综合以上结果，研究者认为ctDNA作为预测未经治疗的滤泡性淋巴瘤（FL）患者早期治疗失败的高风险人群的生物标志物具有很大潜力。在基线时使用AVENIO NHL panel检测量化的MMPM相比于FLIPI 2、m7-FLIPI和SPD模型展示了独立的预后价值。值得注意的是，包括FLIPI评分在内的预后评分工具在接受CHOP/CVP化疗方案的患者中的预后价值十分有限，而MMPM评分体系则不受化疗方案的限制，其在接受CHOP/CVP和Benda化疗方案的患者中均体现了预后价值。

上述墙报中提到的ctDNA检测使用了来自罗氏诊断为非霍奇金淋巴瘤研究开发的AVENIO NHL Assay，其理念来源于经典的CAPP-seq技术^6-8。在全球III期研究POLARIX中，研究人员前瞻性地纳入了ctDNA检测，验证了其对于初治DLBCL患者具有预后价值 。在诊疗不同阶段引入ctDNA检测，使得临床治疗疗效的评估更加细化，有助于指导患者用药，为患者提供精准的个体化诊疗方案。基于该研究，罗氏制药优罗华®于2023年在华获批。

目前，罗氏诊断基于上述Assay，推出了KAPA HyperCap DS NHL Panel，该产品涵盖了383个基因的编码区和部分的非编码区以及部分基因间区域，共覆盖了基因组DNA 341Kb的区域。结合经典的NGS文库制备流程KAPA HyperCap工作流与开源生信分析流程，该Panel能够针对不同的NHL亚型实现ctDNA监测、MRD分析以及细胞起源分析等各个用途，助力在淋巴瘤领域开展临床研究。该Panel还可适配AVENIO Edge System 测序文库制备系统，助力ctDNA NGS自动化、标准化流程建设。

以下为KAPA HyperCap DS NHL Panel 工作流程所需的试剂盒

参考文献

1. Zha J, Fan L, Yi S, et al. Clinical features and outcomes of 1845 patients with follicular lymphoma: a real-world multicenter experience in China[J] J Hematol Oncol. 2021;14(1):131.

2. Kridel R, Sehn LH, Gascoyne RD. Pathogenesis of follicular lymphoma. J Clin Invest. 2012;122(10):3424–3431.

3. Casulo C, Byrtek M, Dawson KL, et al. Early relapse of follicular lymphoma after rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone defines patients at high risk for death: an analysis from the National LymphoCare Study. J Clin Oncol. 2015;33(23):2516–2522.

4. Seymour, John F., et al. "Association of early disease progression and very poor survival in the GALLIUM study in follicular lymphoma: benefit of obinutuzumab in reducing the rate of early progression." Haematologica 104.6 (2019): 1202.

5. Bottos, Alessia, et al. "Identification of High-Risk Population in First-Line Follicular Lymphoma at Screening with a Next Generation Sequencing (NGS) Assay Using Plasma Circulating Tumor DNA (ctDNA): Initial Data from Gallium." Blood 142 (2023): 1629./ ASH 2023

6. Scherer, Florian, et al. "Distinct biological subtypes and patterns of genome evolution in lymphoma revealed by circulating tumor DNA." Science translational medicine 8.364 (2016): 364ra155-364ra155.

7. Kurtz, David M., et al. "Circulating tumor DNA measurements as early outcome predictors in diffuse large B-cell lymphoma." Journal of Clinical Oncology 36.28 (2018): 2845-2853.

8. Newman, Aaron M., et al. "Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA." Nature biotechnology 34.5 (2016): 547-555.