RNAscope®应用：在乳腺癌临床样本中检测LncRNA

lncRNA是指长度超过200个核苷酸的RNA转录本，缺乏蛋白质编码的潜能。目前已经在人类基因组中鉴定出大约14000个lncRNA基因。已发现lncRNA失调不仅与肿瘤的发生有关，在神经系统，心血管疾病以及其他疾病中也起到重要作用。

体外研究肿瘤微环境需要合适的研究平台。研究表明，肿瘤细胞可主动将包括间充质干细胞在内的多种细胞招募到肿瘤微环境中，间充质干细胞是一种多能祖细胞， 有助于维持和再生多种结缔组织， 包括骨骼、脂肪、软骨和肌肉等。越来越多的证据表明，间充质干细胞和乳腺癌细胞之间的相互作用可能影响肿瘤的发生、生长和转移。

作者体外共培养了乳腺癌细胞MCF-7与脂肪源间充质干细胞 (hAD-MSCs)，构建了模拟肿瘤微环境和识别参与肿瘤进展的重要分子的平台，来研究潜在的LncRNA在乳腺癌增殖中的作用。

首先，作者用微阵列技术研究了MCF-7细胞与间充质干细胞共培养诱导上皮间质转化 (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 过程中LncRNA的表达变化，发现LncRNA KB-1732A1.1 (称为LincK, 部分与GASL1重叠) 显著升高 (Fig.1)。

Fig.1 LincK was upregulated during co-culture induced EMT

为了鉴定与表征LincK，作者进行了RACE，Norther-Blot，RNA-FISH等实验，证明了LincK是1.2kb的长链非编码 RNA，并主要定位在细胞质中。

为了研究 LincK 的生物学功能，作者通过体外的慢病毒感染MCF-7细胞来敲除或者过表达LincK，评估EMT标志物的表达情况，证明了LincK诱导乳腺癌细胞发生 EMT；在Transwell Assays中证明了LincK促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭; MTS assay和BrdU incorporation assay证明了LincK增强乳腺癌细胞的增殖和定殖，并在裸鼠体内进行了异种移植试验，证明LincK的下调抑制了肿瘤的发生，而LincK的异位表达促进了肿瘤的生长。

此外，作者利用 RNAscope^® 技术检测了87个临床样本 (8例健康乳腺，33例增生/纤维瘤，46例侵袭性乳腺癌样本，制备成组织微阵列TMA) 中LincK的表达情况 (Fig.2)，证实了在乳腺癌临床样本中，LincK表达上调。作者表示尽管病例有限，观察时间较短，但证实了LincK在正常组织和乳腺癌组织中的表达存在差异。所有数据表明，对LincK表达与临床特征 (包括组织学亚型、治疗反应和生存率) 之间的关系进行更详细和长期的研究是非常重要的。

Fig.2 Representative pictures of LincK scores detected by RNAscope^® technology. Breast tissues specimens consisting of normal, benign and invasive breast cancers (n=87) were hybridized with probes against LincK (up), negative control (medium), and positive control (bottom). The brown dots indicated the target molecules.

另外，作者通过生物信息学分析验证了癌症基因组图谱 (TCGA) 数据集中LincK的异常表达。采用mRNA芯片分析、Western blot、RNA-pulldown和RNA免疫沉淀等方法研究了LincK的潜在机制，推测LincK可能与PBK和ZEB1共享miRNA响应元件，并调控miR-200s的作用。

对这些未知的长链非编码RNA (lncRNAs) 进行研究，势必要使用到RNA原位杂交 (ISH) 技术。相对于蛋白编码基因可以使用免疫组化 (IHC) 和RNA ISH两项技术对特定细胞内基因表达进行互补研究不同，lncRNA基因表达只能通过RNA原位杂交技术进行检测。同时由于lncRNAs在转录水平普遍低于编码蛋白的RNA, 这就对RNA原位杂交技术的敏感度提出了更高的要求。单分子敏感度和快速检测使得RNAscope^®成为检测特定细胞以及特定细胞内亚结构中lncRNAs的理想检测方法。

RNAscope^® ISH 技术是由 Bio-techne旗下 Advanced Cell Diagnostics (ACD) 公司研发的 RNA 原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的 RNA 原位杂交相比， RNAscope^® ISH 技术属于新一代 RNA 原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链 RNA 探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标 RNA。

该技术优势如下：

应用广泛: 使用RNAscope^® ISH 技术，靶点 RNA 为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而 RNAscope 技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

特异性：RNAscope^® 独特的双Z (ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要 2~4 周时间即可完成。

灵敏度：RNAscope^® ISH 技术检测每个 RNA 分子时，只需三对双Z (ZZ) 探针即可完成杂交和信号可视化。

单分子可视化和单细胞定量: 使用 RNAscope^® ISH 技术杂交上三对及以上双Z探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

兼容降解的RNA: 由于仅利用三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

检测结果稳定一致性：由于工业化合成 RNAscope^® ISH 技术用到的探针以及所有检测试剂，且该技术针对不同样本类型 (冰冻切片，石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等) 已经有成熟的实验操作流程，故使得 RNAscope^® ISH 技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在 Leica 以及罗氏 Ventana 自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

多通道多靶点同时检测：由于 RNAscope^® ISH 技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。

Reference:

1.Li et al. LincK contributes to breast tumorigenesis by promoting proliferation and epithelial-tomesenchymal transition.  J Hematol Oncol. 2019 Feb 22; 12(1): 19. 

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