Biolaminin 521应用—2023年度盘点

LN521包被培养hPSC用于构建小型中脑类器官（MiCOs）的高通量化合物筛选模型

本方法主要描述使用LN521包被平板培养hPSC，使用AggreWell^TM 440生产MiCOs，并在EB-Disk360的轨道振动器上维持生长，进而减少对细胞外基质或旋转瓶的需求，也防止类器官的融合。本文也详细介绍了收集和分析不同终点的类器官特点，可用于高通量化合物筛选和疾病模型的构建。

图2 MiCOs的构建步骤

CT521应用于同种异体HLA匹配供体的iPSC系构建，并成功建立覆盖西班牙大部分人口的临床级iPSC库

在全世界范围内，器官衰竭患者急需用移植的细胞和组织，而与年龄相关的退行性疾病的影响越来越大，这些疾病的治疗方法非常有限或没有。细胞疗法可能成为器官移植的替代方案，并可用于治疗退行性疾病（如黄斑变性、帕金森病、心力衰竭、1型糖尿病或脊髓损伤等），还可作为癌症免疫治疗的免疫细胞来源。从体细胞产生人诱导多能干细胞(hiPSC)为获得几乎无限的广谱特化细胞提供了一个独特的机会。使用患者细胞来源的hiPSC，随后分化为所需细胞类型用于治疗，可确保免疫相容性，并将排斥反应风险降至最低。然而，生产定制的hiPSC生产线及其适合人类使用的衍生物所需的时间和成本是非常高的。

本文通过仙台病毒转导对CD34+细胞进行重编程建立的临床级别iPSC单倍体库，这些样本来自西班牙骨髓登记系统临床库提供的7个脐带血单位，这些单位也是常出现HLA单倍型。采用符合GMP要求的方法对其进行扩增和储存，以作为临床级别中间体用于晚期治疗药物的开发。结果显示，该细胞库可通过HLA匹配覆盖超过1/5的西班牙人，并且由于单倍型共享，还将服务于相当大比例的欧洲、北美和南美人群。

图3 部分不同代次三胚层标记物的染色情况

LN521包被培养hPSC用于视网膜色素上皮细胞（RPE）分化过程中染色体复发性异常的研究

人类多能干细胞在细胞培养过程中的无限自我更新能力是其生物医学应用的关键。然而，人造血干细胞具有获得遗传异常的倾向，这些遗传异常赋予了长时间扩增的适应性，这可能会破坏现有的研究结论。最常见和复发性的hPSC异常包括1、12、17、20和X染色体的全部或部分增加。在全世界检测近20%的hPSCs中发现了染色体20q畸变。然而，分化过程中大多数遗传异常的功能影响知之甚少。现有报告指出混合表型，包括体外和体内未成熟畸胎瘤的分化能力降低、延迟或替代。对于再生医学中使用的人造血干细胞衍生物来说，未被发现的异常，特别是与癌症相关的异常，可能会破坏疾病建模和临床试验。

鉴于目前没有系统地评估常见的人造血干细胞遗传异常对RPE谱系的影响。本文研究了在临床视网膜色素上皮分化过程中、在羊膜穿刺中均发现了等染色体20q（iso20q）的复发性异常。结果显示，iso20q异常中断了自发的胚胎谱系分化。在促进野生型hPSCs自发分化的条件下，iso20q变异体不能分化成原始胚层，并下调多能性网络，导致细胞凋亡。通过制定合理的定向分化方案，正确克服iso20q异常。因此，本文揭示了在iso20q中一个染色体异常，它损害了hPSCs向胚层分化，而不是影响羊膜的发育能力，这也是在存有畸变的情况下模拟胚胎发育瓶颈的模型。

图4 携带iso20q异常的hPSCs与WT型hPSCs在自然分化过程中的表型比较

LN521应用于hiPSC的神经元分化、脑类器官构建以研究Tau蛋白病

微管(MT)相关蛋白Tau (MAPT)的毒性积聚是多种神经退行性疾病的标志，包括阿尔茨海默病(AD)、伴帕金森症的额颞叶痴呆-17 (FTDP-17)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)和皮克病(PiD)；这些疾病统称为Tau蛋白病。在健康的大脑中，Tau调节MT的组装和稳定，而在疾病条件下，则过度磷酸化的Tau从MT中分离并聚集形成成对的螺旋细丝（PHF）和神经原纤维缠结。对Tau蛋白病病变机制的有限理解阻碍了对这些疾病的有效治疗。

本项研究中，利用hiPSC衍生的神经元、人类大脑类器官（hCOs）和人类脑组织相关的人类模型系统，研究RNA结合蛋白（RBP）在最常见的Tau蛋白病阿尔兹海默症（AD）中的功能变化。结果显示G3BP2直接结合Tau微管结合区域和阻止Tau聚集，作为抵抗Tau聚集的第一道防线，并揭示了RBP在Tau病中发挥的作用。

图5 G3BP2-Tau相互作用阻止Tau形成聚集体的工作模型

LN521+LN111应用于hESC衍生的多巴胺能神经元移植帕金森病（PD）的细胞替代疗法正进入临床试验阶段

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，其特征是中脑多巴胺（DA）神经元的丢失，主要是位于黑质致密部（SNc）的A9亚型。这些神经元投射到前脑，多巴胺在前脑释放，并调节运动控制的关键方面和认知的某些方面。在PD中，纹状体（尤其是壳核）的多巴胺能神经支配的丧失会导致运动迟缓和强直等运动障碍。

本文提供了支持首次人体STEM-PD Ⅰ/Ⅱa期临床试验的质量、安全性和疗效数据，以及试验设计。STEM-PD产品在GMP要求下生产，并在体外和体内进行质量测试，以满足监管要求。结果显示，在一项为期39周的大鼠GLP安全性毒性、致瘤性和生物分布研究中，未观察到该产品的不良反应，而一项非GLP有效性研究证实，移植细胞介导了PD临床前大鼠模型的功能完全恢复。进一步观察到两个不同GMP批次之间具有高度可比性的功效结果，验证了该产品可以批量化生产。目前，一批经过完全体内测试的STEM-PD正用于2022年开始的一项PD患者临床试验（8例中度患者）。

图6 RC17 MCB和STEM-PD产品的制备和测试

LN521助力iPSC来源的光感受器前体细胞规模化生产用于治疗视网膜退行性失明患者

自从1954年第一例成功的同卵双胞胎肾移植以来，再生医学领域蓬勃发展。与其他器官不同，中枢神经系统（CNS）的成熟组织不能提供同样的移植优势。例如，在视网膜下移植到视网膜变性的小鼠体内后，完整的成熟光感受器细胞片不能延伸轴突或与宿主视网膜中间神经元形成突触连接。相反，发育中的视网膜祖细胞可以很容易的与移植后营养不良的宿主视网膜融合。虽然视网膜祖细胞和有丝分裂后光感受器前体细胞处于视网膜移植的适当发育阶段，但这些细胞只能从晚期胎儿供体视网膜中获取，不符合伦理，而且难以获得足够数量的细胞以供临床使用。

胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）已被用于产生可移植的视网膜祖细胞和光感受器前体细胞。本研究中，使用Cell X^TM精密机器人平台成功制备了临床级别的患者特异性iPSC。这些iPSCs保持正常核型，具有多能性，并且可以分化为可移植视网膜祖细胞和光感受器前体细胞的视网膜类器官，与人工处理生产的细胞没有差异。因此，Cell X平台纳入临床iPSC生产管道将大大提高生产量，实现产品可追溯性，并减少因各种因素导致的批间差。

图7 Cell X^TM机器人精密平台自动生产iPSCs

LN521用于鼠ESC分化心肌细胞研究心肌再生具有Tbx5特异性的心脏前体细胞

根据世界卫生组织的数据，心力衰竭是工业化国家的主要死亡原因，估计每年有1730万人死于心血管疾病，占全球所有死亡的30%。人类心脏再生是全球范围内最重要的未满足临床需求之一。心肌细胞（Cardiomyocytes，CM）的丢失/损伤是心肌疾病的主要原因之一，为了补充丢失和受损伤的细胞，需要适当的来源作为细胞替代治疗方法。心脏前体细胞（cardiacprecursor cells，CPCs）是一种有吸引力的候选细胞，可以驱动其产生成熟的CMs。Tbx5是Holt-Oram综合征的T-box转录因子（TF）单倍不足，在体内外研究中都是心脏发育和成人CM形成所必须的主要TF之一。哺乳动物的心肌细胞更新有可能通过CM去分化和随后的增殖实现。在成年低等脊椎动物种，Tbx5转录网络不仅对启动早期心脏特化至关重要，而且对启动心脏再生程序也至关重要。虽然启动CM增殖程序是目前的主要治疗目标，但Tbx5在成年和出生哺乳动物心室再生中的重要性尚未被研究。

本文通过使用BAC Tbx5CreERT2/CreERT2转基因损伤心脏模型，结果显示过度激活的心脏细胞存在心肌损伤，且有Tbx5表达，标记物在早期心血管前体中表达。Tbx5转录在早期小鼠心脏发育中受一个正反馈回路控制。因此，Tbx5损伤后的过表达可能是启动小鼠和人类CM去分化、分裂或分化重要调控网络的早期尝试之一。

图8 Tbx5谱系（YFP+）示踪细胞在成年损伤小鼠心脏中的实验示意图

多能干细胞来源的心脏祖细胞对猪受损的缺血性心脏进行再灌注并改善功能

缺血性心脏病通常与心肌不可逆损伤相关，是一项重大的全球健康负担。20多年来，细胞疗法（包括基于干细胞的方法）一直被认为是治疗心肌梗死（MI）的可能方案，但迄今为止，开发此类疗法的尝试均未成功。包括将人多能干细胞（hPSCs）来源的未成熟心肌细胞（CMs）移植到心肌梗死的实验猪和非人灵长类动物的早期研究。虽然在已经梗死的宿主心脏中观察到成功植入，但严重的副作用（移植物诱发的快速性心律失常和死亡）阻碍了其在人类患者中的应用。其中一项研究结果提示，对移植的CMs细胞采取药物手段或超速起搏可避免短暂的心动过速发生，但尚未证明这种成熟的CMs在心脏再生方面完全起效。

在目前的研究中，作者研究了大约2亿个第11天的心脏祖细胞（CCPs），以研究它们再生受损心脏组织的潜力。人多能胚胎干细胞在LN521+LN221基质上分化为CCPs，用于单细胞RNA测序，并移植到梗死的猪心脏中。与分化7天的细胞相比，分化11天的CCPs表达一组更高的基因。心脏功能研究显示移植后4周和12周左心室射血分数显著改善。还观察到CCPs移植后心室壁厚度的显著改善和梗死面积的减少。免疫组化分析显示CCPs在体内成熟为CMs。观察到4只猪出现短暂的室性快速性心律失常（VT），1只猪出现持续性VT，其余5只猪窦性心律正常。重要的是，所有的实验猪都存活下来，没有形成任何肿瘤或VT相关异常。即多能干细胞衍生的CCPs构成了心肌梗死治疗的一种有前景的可能性，并可能对再生心脏病学产生积极的影响。

图9 CCPs生产与移植示意图

参考文献

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