干货 | NK细胞标记物大盘点！

那么，该如何捕捉到NK细胞的英姿呢？

一般我们会采用一些特定表达的蛋白作为标记物，通过检测这些标记物不仅可区分NK细胞及其他淋巴细胞，还可以对NK细胞分型、发育、活化和抑制等情况进行深入分析。

本期小P将全面给大家介绍NK细胞的标记物，文中还有NK细胞鉴定和区分方案可借鉴并直接上手！当然小P还准备了流式技术指南，文末可领取哦！下面且听小P娓娓道来！

NK细胞介绍

NK细胞（natural killer cells）作为独特的淋巴样细胞，在人体中占循环淋巴细胞的5-20%，在小鼠模型中占脾脏和骨髓淋巴细胞的2-5%。

作为固有免疫的重要组成部分，NK细胞既能在没有预先致敏的情况下裂解靶细胞，直接促进免疫；还能通过产生细胞因子和趋化因子，间接影响免疫反应。

NK细胞独特之处：

NK细胞分型及其标记物

人类NK细胞具有两种特异性标记物：CD56（神经细胞粘附分子-1，NCAM1）和CD16（Fc受体FcγRⅢ）。根据这两种表面蛋白的表达差异，可将NK细胞分为两个主要亚群：CD56^bright（CD56^brightCD16^lo/−）和CD56^dim（CD56^dimCD16⁺）。

表1 人类NK细胞亚群及其常见标记物[1,2]

注：bright，高水平表达；lo，低水平表达；dim，微弱表达；-，不表达。

 图1：人类NK细胞分布和分型（图源参考文献3）

与人类不同，小鼠NK细胞不表达CD56，但其可通过CD27（肿瘤坏死因子受体超家族7，TNFRSF7）和CD11b（整合素αM）进行分群，即CD11b^lowCD27⁺、CD11b^+hiCD27^-和CD11b^+hiCD27⁺。

表2 小鼠NK细胞亚群及其常见标记物[4]

注：CXCR3，CXC-趋化因子受体3；KLRG1，杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1；low，低水平表达；+hi，高水平表达

图2：小鼠NK细胞分布和分型（图源参考文献3）

特别注意：但不管是小鼠还是人类NK细胞，均表现出一定程度的可塑性，即细胞因子的激活可以改变其表型和功能，如IL-2培养可诱导CD56^bright产生CD16和KIRs。因此，在NK细胞亚群或与其他ILC的识别和区分中需要额外注意。例如，细胞因子处理可大大增强CD56^brightNK细胞亚群的细胞毒性，使其“看起来”更像D56^dimNK细胞[5]。

NK细胞发育及其标记物

NK细胞由骨髓和次级淋巴组织（扁桃体、脾脏和淋巴结）中的共同淋巴祖细胞（CLP）发育而来。

CLP产生共同天然淋巴细胞（ILC）前体（CILCP），后者可产生NK细胞和辅助样ILCs。从CILCPs开始，小鼠NK细胞发育至少细分为5个阶段：NK细胞前体（NKP）→refined-NKP（rNKP）→CD27⁺CD11b^-NK细胞→CD27⁺CD11b⁺NK细胞→CD27^-CD11b⁺NK细胞。

每个发育阶段均有标记物。在NKP的维持和发育需要转录因子T-bet、Id2和Nfil3的支持，而Eome的表达在后期诱导。rNKP阶段表达CD122。未成熟的CD27⁺CD11b⁻NK细胞表达激活受体NK1.1、NKG2D和NKp46。它们进一步分化为CD27⁺CD11b⁺NK细胞，并表达S1P5，使其能够从骨髓转移至外周。成熟的CD27⁻CD11b⁺NK细胞通过抑制细胞表面受体KLRG1的表达终止分化。

特别注意：由于成熟的小鼠NK细胞也表达CD11b，因此在排除髓系细胞时，必须检查NK1.1⁺和/或NKp46⁺CD11b⁺细胞未被排除在相关的设门策略中。

人NK细胞功能与小鼠NK细胞相似，但发育过程及其标记物不同。

在人体中，存在一个类似于CLPs并能产生ILCs所有亚群的多能祖细胞[6]。CLP发展出ILC限制性CILCP，进而产生NK限制性NKP。这些NKP的特征是表达CD122而CD34和CD127缺失。进一步分化为功能性NK细胞需要T-bet和Eomes的表达。而CD56的表达将NK细胞分为两个亚群（CD56^bright和CD56^dim）。CD56^dim表达CD16, PEN5和CD5。部分研究认为CD56^bright是CD56^dim前体（如下图虚线所示）[7]。两个细胞亚群均表达活化表面受体NKp46和NKp80。

 图3：人类和小鼠中NK细胞发育（图源参考文献3）

NK细胞受体：活化和抑制

NK细胞无需抗原预先致敏即可发挥免疫监视和杀伤作用，那么它们是靠什么进行“感受”呢？表面受体发挥重要作用，这些受体传递的活化和抑制信号之间的平衡精细地调节了NK细胞功能。

 图4：通过抑制和激活相互作用对NK细胞功能进行精细调节[8]

在人体中，表达正常水平配体的NK细胞对健康细胞具有耐受性，即高人MHC（HLA）I类分子和低活化配体。应激诱导配体过度表达时，NK细胞可杀死病理性（如肿瘤或病毒感染）细胞。NK细胞活化和抑制的关键介质如下表。

表2：NK细胞关键介质[9] 

组织驻留NK细胞及其标记物

除了血液循环中的NK细胞，还有一类分布于各个组织（包括淋巴结、胸腺、肝、肺等）的组织驻留NK细胞（trNK）。这类NK细胞毒性较低，在不同组织中发挥着不同功能，并具有不同的细胞因子和KIR（杀伤细胞免疫球蛋白样受体）表达谱。

肝脏中富含CD56^brighNK细胞，其特征在于特殊的转录因子谱，包括HOBIT、T-BET、高EOMES表达和TIGIT⁺CD69⁺CXCR6⁺CD49e^-表型[8]。肠道trNK细胞可通过NKp46和NKp44的差异表达分为两个亚群：NKp44⁻NKp46⁺和NKp44⁺NKp46⁻[10]。

 图5：人NK细胞表型多样性（图源参考文献11）

NK细胞鉴定和区分方案

Human：CD3^-CD56⁺CD16^+/-

Mouse：CD3^-CD49b⁺/NK1.1⁺

CD56是NK细胞特异性标记物。但外周血中含有一类特殊的T细胞——NKT细胞，它即有T细胞受体TCR也有NK细胞受体（CD3⁺CD56⁺），因此需要借助CD3来排除。

图6：Human TBNK Basics Panel结果图（图源Proteintech）

本方案通过特异性标记物，将淋巴细胞分为T淋巴细胞（CD3⁺，Q3区域）、B淋巴细胞（CD19⁺，Q1区域）和NK细胞（CD3^-CD19^-，Q4区域）。

在此基础上加入Drop-in标记物CD16（CoraLite® Plus 555 Anti-Human CD16），还可圈出CD3^-CD19^-NK细胞分析CD16和CD56的表达。

本方案用于分析NK细胞（CD3^- CD226⁺），并按CD56和CD16的表达将NK细胞分为不同亚群。

图6：Human NK Basics Panel结果图（图源Proteintech）

很多小伙伴可能会疑惑，在多色实验设计中，有些研究者会把CD16和CD56设置为同一个荧光，有些会选择不同荧光。不同设计方法得到的结果有什么区别吗？

其实，CD16和CD56是否选择同种荧光，取决于实验目的：

• 仅需要分析NK细胞在淋巴细胞中的占比，可以选择同种荧光，以CD3^-(CD56+CD16)⁺形式进行分析。

• 需要进行细化分析，建议选择不同荧光，以CD3^-CD56⁺CD16^+/-形式进行分析。

常用NK细胞功能检测及其标记物

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参考文献

[1] Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Front Immunol. 2018 Aug 13;9:1869.

[2] Cooper MA, Fehniger TA, Caligiuri MA. The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol. 2001 Nov;22(11):633-40.

[3] Crinier A, Narni-Mancinelli E, Ugolini S, Vivier E. SnapShot: Natural Killer Cells. Cell. 2020 Mar 19;180(6):1280-1280.e1.

[4] Huntington ND, Vosshenrich CA, Di Santo JP. Developmental pathways that generate natural-killer-cell diversity in mice and humans. Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):703-14.

[5] Loza, M. J. & Perussia, B. The IL-12 signature: NK cell terminal CD56+high stage and effector functions. J. Immunol. 172, 88–96 (2004).

[6] Scoville, S.D., Mundy-Bosse, B.L., Zhang, M.H., et al. (2016). A Progenitor Cell Expressing Tran-scription Factor RORgt Generates All Human Innate Lymphoid Cell Subsets. Immunity 44, 1140–1150.

[7] Björkström NK, Ljunggren HG, Michaëlsson J. Emerging insights into natural killer cells in human peripheral tissues. Nat Rev Immunol. 2016 Apr 28;16(5):310-20.

[8] Quatrini L, Della Chiesa M, Sivori S, Mingari MC, Pende D, Moretta L. Human NK cells, their receptors and function. Eur J Immunol. 2021 Jul;51(7):1566-1579.

[9] Wu SY, Fu T, Jiang YZ, Shao ZM. Natural killer cells in cancer biology and therapy. Mol Cancer. 2020 Aug 6;19(1):120.

[10] Le T, Reeves RK, McKinnon LR. The functional diversity of tissue-resident natural killer cells against infection. Immunology. 2022 Sep;167(1):28-39.

[11] Freud AG, Mundy-Bosse BL, Yu J, Caligiuri MA. The Broad Spectrum of Human Natural Killer Cell Diversity. Immunity. 2017 Nov 21;47(5):820-833.

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