细胞周期简介
细胞周期（cell cycle）是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂完成到下一次分裂结束的循环过程，一般分为间期和分裂期两个阶段。其中分裂间期持续时间远长于分裂期，在一个正常的细胞周期中，间期持续时间约占整个细胞周期的90%左右。在间期中，细胞会生长、复制染色体，并为分裂做准备。然后，细胞离开间期，经历有丝分裂，并完成其分裂，由此产生两个子细胞。癌变的细胞以及特定阶段的胚胎细胞常常有异常的分裂周期。
1.间期：包含3个不同时期，即G1（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）。
2.分裂期（M期）：发生细胞核和细胞质分裂，产生两个子细胞。
3.静止期（G0期）：指细胞离开周期并停止分裂的阶段。细胞周期从这个阶段开始。处于G0期的细胞没有积极准备分裂，该细胞已退出细胞周期，处于静止（非活动）阶段。有些细胞会暂时进入G0期，直到外部信号刺激进入G1期合成DNA和进行细胞分裂，如肝、肾和胃细胞；其他永不分裂或很少分裂的细胞，如成熟的心肌和神经细胞，永久保留在G0期；也有一些细胞因持续分裂而从不进入G0期，并在生物体的整个生命周期中持续分裂，如上皮细胞。
图1：细胞周期（图源参考文献1）
值得注意的是，不同类型细胞G1期长短不同，所以细胞周期持续时间存在差异，如HeLa细胞为21h（G1期为10h，S期为7h，G2期为3h，M期为1h）、CHO细胞为14h、小鼠十二指肠上皮细胞为10h、人类胃上皮细胞为24h......
表1：细胞周期各阶段及其特点
细胞周期标记物
细胞周期的关键蛋白主要有：细胞周期蛋白Cyclin，周期蛋白依赖性激酶CDKs（cyclin-dependent kinases），CDK抑制因子CKIs（cyclin-dependent kinase inhibitors）和CDK激活激酶CAK（CDK-activating kinase），它们在不同时期发挥各自重要的作用：
1.G1期
G1期收到有丝分裂信号后，D型细胞周期蛋白（Cyclin D1/2/3）上调，Cyclin D结合并激活催化伙伴CDK4/6。Cyclin D-CDK4/6磷酸化各种细胞靶点，其中最重要的是视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，RB）。
RB先被Cyclin D-CDK4/6部分磷酸化，导致转录因子E2F释放并上调其靶标。在E2F上游靶标中，有两个E型细胞周期蛋白（Cyclin E1/2），它们结合并激活CDK2。后RB被Cyclin E-CDK2完全磷酸化，从而释放E2F转录程序并导致细胞进入S期所需的蛋白质的合成。
图2：RB和E2F参与G1期调控（图源参考文献2）
2.S期
多种蛋白（ORCs、CDC6、CDT1和MCMs）在G1期聚集在DNA复制的起点上，随后DBF4-CDC7和Cyclin E-CDK2一系列连续磷酸化触发DNA复制，并促进CSC和GINS、MCMs的结合，进而激活DNA解旋酶，最终触发细胞进入S期。随后，Cyclin E-CDK2在DNA复制起点的触发作用被Cyclin A-CDK2接管。
3.G2/M期
Cyclin A在S期和G2/M期中均发挥重要作用，其在G2/M期转变过程中的关键功能是激活Cyclin B-CDK1。激活后，Cyclin B-CDK1磷酸化多种蛋白，其中大多数与有丝分裂进程和细胞分裂相关，如细胞骨架重组、核包膜分解、染色体凝聚、有丝分裂纺锤体组装和功能、染色体分离和胞质分裂等。
G2期中，Cyclin A-CDK1是主要作用蛋白；M期中，Cyclin B-CDK1是主要作用蛋白。
表2 细胞周期各阶段特征蛋白[3]
*CKI
Cyclin正向调控CDK，CKI负向调控CDK。CKI可分为抑制CDK4/6的INK4家族（主要有p16、p15、p18和p19），抑制所有CDK（包括CDK1/2/4/6）的KIP/CIP家族（主要有p21、p27和p57）。
*CAK
CAK是细胞周期的主要驱动力，其通过磷酸化其T环内的关键苏氨酸残基来激活CDK。此外，CAK依赖性磷酸化可稳定一些Cyclin-CDK复合物，例如Cyclin B-CDK1[4]。
图3：细胞周期及其关键蛋白（图源参考文献4）
细胞周期检查点
DNA复制的保真度、完整性以及姐妹染色单体的及时准确分离是由多种细胞周期检查点控制的。若出现异常（环境变化、DNA损伤等），检查点则会“亮起红灯”阻滞进程，同时启动修复/凋亡程序。
细胞周期有2个重要的检查点：G1/S期检查点、G2/M期检查点。
1. G1/S检查点
细胞增殖调控关键点，可调控细胞从静止状态进入DNA合成期。
在G1期，Cyclin D-CDK4/6和Cyclin E-CDK2磷酸化RB蛋白，释放E2F，通过G1/S检查点，以准备合成蛋白质和DNA。
2. G2/M检查点
决定细胞一分为二，保证细胞有充足的时间将损伤的DNA得以修复。
在S期复制基因组DNA后，G2期的细胞通过G2/M检查点，其中DNA合成期的错误激活DNA损伤途径，通过ATR-Chk1-WEE1/CDC25C信号轴抑制Cyclin B-CDK1活性。
3. 纺锤体组装检查点（SAC）
有丝分裂检查点复合物（MCC）抑制APCCdc20 E3连接酶活性，从而阻止Cyclin B和分离酶抑制蛋白securin的降解，以阻止有丝分裂进程[5]。
图4：细胞周期检查点（图源参考文献5）
细胞周期常规检测方法
细胞周期检测方法有很多，小P主要介绍以下3种类型：DNA含量分析、有丝分裂/增殖Marker、细胞周期同步诱导。
1.DNA 含量分析
通过流式细胞术测定DNA含量进行细胞周期分析，确定不同时期的细胞群百分比。
（1）检测原理
由于细胞周期各阶段DNA含量不同，因此可使用DNA特异性结合染料对其进行标记和含量检测。检测时，先对细胞进行固定或通透，再用染料如碘化丙啶（PI）孵育，然后通过流式细胞术进行分析。PI信号的荧光强度与DNA含量呈正比。DNA含量的直方图可以估计G1/G0、S和G2/M期的细胞数量。
注：2N和4N指细胞的倍性水平，它表示细胞所包含的完整染色体组的数量。这些术语是相对于一个特定的碱基值“N”，代表物种的单倍体染色体数目。
（2）实验数据分析
图中为HeLa细胞周期分布图，横坐标为DNA含量，用于区分细胞周期的不同阶段。纵坐标为细胞数量，每个峰的高度反映了细胞周期特定阶段中细胞的比例。
第一个峰：G0和G1期；G1期是DNA含量最少得时期，DNA复制还未开始；G0期是细胞静止期，不复制DNA，无法与G1期区分开。
而第一个峰左侧区域为sub-G1期，均为发生凋亡的细胞，和细胞周期没有关系。
第二个峰（不高但很宽）：S期；从细胞开始复制到完成复制，是一个DNA含量从2N到4N增加的过程。
第三个峰：G2和M期；G2期是DNA复制完成至分裂的一段时间，DNA含量为4N；M期是细胞分裂的过程，DNA含量为4N，无法与G2期区分开。
图5：细胞周期流式细胞术结果分析图（图源Proteintech）
2.有丝分裂/增殖Marker
通过免疫荧光技术检测细胞有丝分裂/增殖的标志物标记不同时期的细胞，通常应用磷酸化组蛋白（Phospho-Histone H3 Ser10）和微管蛋白（Alpha Tubulin）的荧光抗体标记检测。
（1）磷酸化组蛋白
组蛋白Histone H3在磷酸化状态下形成真核生物染色质的主要成分，出现在G2早期的着丝粒（centromere）周围异染色质，并以有序的方式与有丝分裂染色体缩合一致地扩散，可作为有丝分裂的标志物。
（2）微管蛋白
微管蛋白Alpha Tubulin是构成微管的基本组成部分，在有丝分裂过程中，微管从中心体成核并聚合形成有丝分裂纺锤体，在细胞分裂过程中引导复制染色体的分离。
图6：磷酸化组蛋白和微管蛋白标记的免疫荧光图（图源Proteintech）
（A）Phospho-Histone H3（Ser10）抗体（66863-1-Ig）标记C2C12细胞纺锤体；（B）Alpha Tubulin抗体（11224-1-AP）标记HepG2细胞纺锤体；（C）Alpha Tubulin抗体（66031-1-Ig）标记HeLa细胞纺锤体
（3）Ki-67
Ki-67是一种核蛋白，在所有增殖细胞中都有表达，但在静息细胞（G0期）中不存在。这使其成为一个经典的细胞增殖标志物，并被广泛应用于临床癌症组织病理学。
图7：Ki-67抗体（27309-1-AP）标记增殖的HeLa细胞（图源Proteintech）
3. 细胞周期同步诱导
通过化学封锁使处于细胞周期不同阶段的培养物中的细胞进入同一时期的过程。
（1）检测原理
在一般培养条件下，群体内的细胞处于不同的细胞周期阶段。化学封锁即用化学抑制剂阻滞细胞停留在细胞周期的某一阶段，常用于细胞周期检查点，常用抑制剂有胸苷、诺考达唑等。
通过同步细胞在同一时期，可以完成：
1）研究在特定时期发生的事件，例如，同步细胞在S期可以研究DNA复制的过程。
2）比较细胞在不同时期的活动，例如，比较G1和G2细胞的基因表达谱。
3）鉴定和表征细胞周期调节蛋白，同步细胞可以用来筛选参与调节细胞周期的蛋白质。
4）提取其表达依赖于细胞周期阶段的瞬时因子。
（2）实验数据分析
以HeLa细胞为例，可由两种方法分析/评估细胞同步化结果：
A. 流式细胞术DNA含量分析
a) Control：具有2N、2N-4N和4N DNA含量的细胞预期分布的未处理的HeLa细胞。
b) G1/S arrest：用2mM胸腺嘧啶处理24h的HeLa细胞G1/S期峰值变高，G1/S期细胞数增多，胸腺嘧啶将细胞阻滞在了G1/S检查点，导致细胞在进入S期之前在G1期积累。
c) G2/M arrest：用100ng/mL诺考达唑处理18h的HeLa细胞G2/M峰值变高，G2/M期细胞数增多，诺考达唑将细胞阻滞在了G2/M检查点，积累的细胞无法退出有丝分裂。
图8：化学抑制剂处理后的流式结果图（图源：Proteintech）
B. 免疫印记（WB）分析特征蛋白
a) G1/S arrest：2mM胸腺嘧啶处理24h的HeLa细胞，细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、Cyclin B1、Cyclin B2和叉头框蛋白M1（FOXM1）上调。
图9：Cyclin D1抗体（26939-1-AP，图A）和FOXM1抗体（13147-1-AP，图B）检测胸腺嘧啶处理前后的HeLa细胞
b) G2/M arrest：100ng/mL诺考达唑处理18h的HeLa细胞，Cyclin B1、Cyclin B2、FOXM1、细胞分裂周期蛋白25 C（CDC25C）上调，Cyclin E1下调。
图10：Cyclin E1抗体（11554-1-AP，图A）和CDC25C（16485-1-AP，图B）检测诺考达唑处理的HeLa细胞
细胞周期及其标记物海报
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参考文献
1. Kennedy S, Berrett H, J. R. Disruption of Cell Cycle Machinery in Pancreatic Cancer [Internet]. Pancreatic Cancer - Molecular Mechanism and Targets. InTech; 2012.
2. Shen W, Tong D, Chen J, et al. Silencing oncogene cell division cycle associated 5 induces apoptosis and G1 phase arrest of non-small cell lung cancer cells via p53-p21 signaling pathway. J Clin Lab Anal. 2022 May;36(5):e24396.
3. Jackman J, O'Connor PM. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 2001 May;Chapter 8:Unit 8.3.
4. Suski JM, Braun M, Strmiska V, Sicinski P. Targeting cell-cycle machinery in cancer. Cancer Cell. 2021 Jun 14;39(6):759-778.
5. Liu J, Peng Y, Wei W. Cell cycle on the crossroad of tumorigenesis and cancer therapy. Trends Cell Biol. 2022 Jan;32(1):30-44.
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