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技术 | 利用双萤光素酶检测揭示非编码RNA在疾病中的作用

云南泽浩

2025-10-28

导读：利用双萤光素酶检测揭示非编码RNA在疾病中的作用近年来，非编码RNA——尤其是微小RNA（miRNA）和长链

利用双萤光素酶检测揭示非编码RNA在疾病中的作用

近年来，非编码RNA——尤其是微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）——已成为细胞行为的重要调控因子。这些分子通过靶向mRNA抑制其翻译或促进降解来调节基因表达。两项最新研究（一项聚焦骨关节炎，另一项针对5-氟尿嘧啶耐药的结直肠癌）揭示了这些非编码调控RNA如何在疾病相关信号网络中发挥作用，为治疗干预提供了新靶点。

两项研究均采用pmirGLO双萤光素酶miRNA靶标表达载体评估预测的miRNA活性。该双萤光素酶系统通过生物发光信号输出，为验证miRNA与mRNA的相互作用提供了简洁且可量化的方法。研究者将候选靶基因的3′非翻译区（UTR）克隆至萤火虫萤光素酶报告基因下游，并以海肾萤光素酶作为内参，从而快速确认miRNA是否直接调控其靶标。

关于pmirGLO 报告基因技术：

细胞水平的验证方法
久经验证的报告基因检测法
适用于内源miRNA 活性研究
携带新霉素抗性

研究一：

骨关节炎中的自噬重编程

在炎症性骨关节炎模型中，Li等人（2025年）发现，在暴露于白细胞介素-1β的软骨细胞中，miR-103-3p表达上调，促进了细胞凋亡和细胞外基质降解——这是软骨破坏的关键特征。作者推测miR-103-3p可能通过抑制翻译调控因子CPEB3发挥作用。他们将CPEB3的野生型和突变型3′UTR克隆至pmirGLO载体中，并与miR-103-3p模拟物共转染至软骨细胞。结果显示，野生型UTR存在时萤火虫萤光素酶活性显著下降，而结合位点突变后活性未受影响，证实miR-103-3p直接靶向CPEB3。机制上，该互作激活PI3K/Akt/mTOR通路、抑制自噬并加剧软骨损伤。重要的是，阻断miR-103-3p可逆转上述效应，提示新的治疗方向。

研究二：

破解结直肠癌的5-氟尿嘧啶耐药性

在另一项概念相关的研究中，Lu（2025年）探索了结直肠癌细胞如何逃逸5-氟尿嘧啶（5-Fu）的细胞毒性作用。研究发现，长链非编码RNA NOP14-AS1在5-Fu耐药细胞中过表达。生物信息学分析预测NOP14-AS1含有miR-30a-5p的结合位点，而该miRNA被预测可结合LDHA基因的3'UTR。LDHA是糖酵解中催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，在包括5-Fu耐药结直肠癌细胞模型在内的多种癌症中表达上调，且这些细胞的葡萄糖摄取与乳酸生成显著增加。通过萤光素酶检测和RNA pull-down实验证实了预测的miRNA结合位点。在萤光素酶检测中，将LDHA的3'UTR或NOP14-AS1的lncRNA序列插入pmirGLO载体的萤光素酶基因下游。结果表明，NOP14-AS1作为miR-30a-5p的分子海绵，降低其在5-Fu耐药细胞中调控LDHA表达的能力。过表达miR-30a-5p可抑制LDHA水平、减弱糖酵解并恢复药物敏感性。这一lncRNA-miRNA-mRNA轴（NOP14-AS1 → miR-30a-5p → LDHA）揭示了可利用的代谢检查点。

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总结

两项研究均遵循以下流程：从观察到的功能表型（如凋亡、耐药性）出发，通过生物信息学预测候选非编码RNA，将潜在靶基因的3′UTR克隆至pmirGLO载体以验证互作，并使用过表达或抑制实验确认非编码RNA调控基因表达的下游效应，从而揭示潜在治疗靶点。

参考文献

Li J. et al. (2025) MiR-103-3p regulates chondrocyte autophagy, apoptosis, and ECM degradation through the PI3K/Akt/mTOR pathway by targeting CPEB3. J Orthop Surg Res. 20:324. DOI
Lu YN. (2025) Blocking lncRNA NOP14-AS1 overcomes 5-Fu resistance of colon cancer cells by modulating miR-30a-5p-LDHA-glucose metabolism pathway. Discov Oncol. 16:458. DOI

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pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector	20µg	E1330
Dual-Luciferase® Reporter Assay System	100 assays*	E1910
Dual-Glo® Luciferase Assay System	100ml*	E2940
GloMax® Discover System	1台	GM3000

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