活细胞成像 | 实时可视化β-连环蛋白动态，解析Wnt信号通路！

Wnt/β-连环蛋白通路是细胞调控生长、修复与更新的核心通路之一。 Wnt得名于Wingless与Int-1基因的融合词，代表一类能触发增殖、迁移和极性等细胞反应的分泌信号蛋白家族²。β-连环蛋白(β-catenin)是具有双重功能的蛋白质：既参与细胞膜间的锚定连接，又作为转录共激活因子在细胞核内发挥作用³。该通路在胚胎早期发育阶段活跃，并持续影响生命过程——尤其在皮肤、肠道和毛囊等快速更新组织中¹。

分子层面上，该通路受控于精密调控β-连环蛋白稳定性的"降解复合体"。当Wnt信号缺失时，APC、Axin及激酶CK1α与GSK3β等蛋白构成的复合体会靶向降解β-连环蛋白⁴。其中Axin作为支架蛋白整合复合体组分，促进β-连环蛋白磷酸化及后续降解4。而当Wnt配体存在时，降解复合体解离使β-连环蛋白逃逸降解，在胞质积累并转位至细胞核，激活c-MYC、cyclin D1和CD44等基因——其中多数与细胞增殖和癌症进展相关⁵。

β-连环蛋白从胞质到细胞核的转位过程，实质上是决定细胞命运的关键调控信号。健康组织中该过程受到严格调控，但在癌症（尤其结直肠癌）组织中，APC或CTNNB1（编码β-连环蛋白）等基因突变可打破平衡导致信号失控⁶。事实上约90%的结直肠癌存在该通路的功能失调突变⁷，这使其成为疾病发生的重要驱动力和治疗靶点。

研究者正利用该通路探索疾病机制及治疗方法。例如CTNNB1基因突变有助于划分Wnt驱动型髓母细胞瘤亚型¹；DKK1和SFRP1等Wnt抑制剂的甲基化状态与白血病和结直肠癌预后相关。即使在非癌症领域，血清DKK1等蛋白也正作为心血管风险和认知衰退的预测指标进行研究¹。这些发现共同确立了Wnt/β-连环蛋白在广泛疾病中作为临床干预靶点的价值。

基于萤光素酶的报告基因检测在发现Wnt/β-连环蛋白信号（特别是β-连环蛋白驱动的核内转录活性）抑制剂方面发挥关键作用。在一项研究中，研究人员采用β-连环蛋白响应型萤光素酶报告基因系统，从近15,000种化合物中筛选出能抑制Axin下游经典Wnt信号的小分子。这项高通量筛选发现了iCRT类化合物，可破坏β-连环蛋白与TCF（激活Wnt靶基因的关键伙伴）的相互作用。值得注意的是，iCRT化合物（iCRT3, iCRT5, 和 iCRT14）能选择性抑制具有组成型Wnt活性的结肠癌细胞存活，并在小鼠模型中抑制肿瘤生长，彰显了靶向核β-连环蛋白功能的治疗潜力⁸。

此类研究凸显功能检测对发现Wnt通路抑制剂的价值。虽然前述RNAi研究中使用的萤光素酶报告基因系统能提供群体水平的通路活性数据，但无法揭示这些相互作用在细胞内的具体发生位置，或细胞群体反应的均一性。β-连环蛋白的核转位是Wnt激活的标志特征，实时追踪该过程可验证候选化合物是否按预期干扰通路。

传统报告基因检测使用微孔板读数仪（如GloMax^® Discover微孔板读数仪）采集细胞群体的相对发光单位（RLU）。虽然能判断β-连环蛋白在核内是否激活，但无法显示单个细胞的时序响应或群体反应的一致性。荧光成像可提供部分时空信息，但常需过表达、固定或染色等处理，限制活细胞分辨率。生物发光成像作为互补方案，允许研究者使用工作流程中的相同报告系统，在单细胞水平可视化活细胞内β-连环蛋白动态。这种多层次信息能强化分子相互作用与细胞表型的关联解析，最终揭示通路调控如何转化为表型变化。

通过生物发光成像技术，我们能在无需过表达或严苛处理的条件下，动态观察活细胞中β-连环蛋白的定位。近期实验中，Promega研究人员采用HiBiT蛋白标记系统为内源β-连环蛋白添加小分子发光标记。当与LgBiT和Nano-Glo^®活细胞底物联用时，发光信号可准确反映β-连环蛋白的丰度与定位。如下方动画所示：未处理细胞中β-连环蛋白主要滞留于胞质；而使用AZD2858（阻断β-连环蛋白降解的抑制剂）处理后，细胞在5小时的时程内呈现明显的β-连环蛋白核内积累。

1. Liu, J., et al. (2022). Wnt/β-catenin signalling: function, biological mechanisms, and therapeutic opportunities. Signal Transduction and Targeted Therapy, 7, Article 3. 

https://doi.org/10.1038/s41392-021-00762-6 

2. Nusse, R., & Varmus, H. (1982). Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell, 31(1), 99–109. 

https://doi.org/10.1016/0092-8674(82)90409-3

3. Clevers, H. (2006). Wnt/β-catenin signaling in development and disease. Cell, 127(3), 469–480. 

https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.10.018 

4. MacDonald, B. T., Tamai, K., & He, X. (2009). Wnt/β-Catenin Signaling: Components, Mechanisms, and Diseases. Developmental Cell, 17(1), 9–26. 

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2009.06.016

5. Jeong, W.-J., Ro, E. J., & Choi, K.-Y. (2018). Interaction between Wnt/β-catenin and RAS-ERK pathways. NPJ Precision Oncology, 2, Article 5. 

https://doi.org/10.1038/s41698-018-0049-y

6. Kim, G., et al. (2018). Nuclear β-catenin localization and mutation of the CTNNB1 gene. Modern Pathology, 31(10), 1553–1559. 

https://doi.org/10.1038/s41379-018-0080-0

7. The Cancer Genome Atlas Research Network et al. (2013). The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics, 45(10), 1113–1120. 

https://doi.org/10.1038/ng.2764

8. Gonsalves, F. C., et al. (2011). An RNAi-based chemical genetic screen identifies three small-molecule inhibitors of the Wnt/Wingless signaling pathway. PNAS, 108(15), 5954–5963. 

https://doi.org/10.1073/pnas.1017496108 

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