细胞污染—支原体篇
众所周知，培养细胞最担心的就是污染，支原体污染是很常见并棘手。在污染早期较难发现，当发现细胞形态异常时，需要及时进行排查，否则会给实验造成极大影响。本文为大家介绍支原体以及检测方法。
支原体的介绍
支原体是一类广泛存在于自然界的、最小的、没有细胞壁的原核细胞型微生物，大小为 0.15～0.3 μm，厚度为7.5~10.0nm。支原体革兰染色为阴性，吉姆萨染色为阳性。支原体种类繁多，但仅部分支原体对人类有致病性，一般通过黏附在宿主上皮细胞表面，从而成为人类、动物和植物的寄生物，通过摄取宿主细胞的胆固醇等营养物质和/或代谢产生的毒素、过氧化氢等有毒物质危害人类和动植物，给细胞制剂和科研工作带来负面影响。
支原体于1956年被正式命名，自 1898年法国科学家Nocard和Roux首次分离该类微生物以来，现已分离出200种支原体。支原体为柔膜体纲（Mycoplasmas），在支原体目里有支原体科（Mycoplasmataceae）、无胆甾原体科（Cholesterogen free）和螺原体科 （Spiroplasmataceae），其中支原体科由支原体属（Mycoplasma）与脲原体属（Ureaplasma） 组成，支原体属有肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）、人型支原体（Mycoplasma hominis ）、生殖支原体（Mycoplasma genitalium）、穿透支原体（Mycoplasma penetrating）和发酵支原体（Mycoplasma fermentans）等75余种。
支原体（图片来源于网络）
支原体的检测方法
电子显微镜法
支原体大小为0.15~0.3μm，形态各异，有球状、环状、丝状、分枝状；支原体无细胞壁，有细胞膜，胞内有核糖体、线粒体、多种酶类、RNA以及环状双链DNA。当细胞制剂被支原体污染时，用透射/扫描电镜观察到在细胞表面和/或细胞核外、细胞周围、细胞间隙有支原体黏附，透射电镜观察结果与操作者的技能和经验有关。
细胞被支原体感染（图片来源于网络）
形态各异的支原体（图片来源于网络）
培养法
在《中华人民共和国药典》中规定培养法检测支原体的“金标准”，其优点是可以检测不同生长特性的支原体，具有广谱性，其缺点是敏感性较低，耗费时间长，成本较高，无法明确支原体的亚型。
根据支原体是利用葡糖糖还是精氨酸，分为2类支原体培养体系。根据培养体系是否含有琼脂以及含量分为液体培养基、半固体和固体培养体系。在富含葡糖糖的支原体肉汤培养基中，由于支原体分解葡萄糖产生酸，在酚红指示剂的作用下，液体培养基的颜色变黄；在富含精氨酸的支原体肉汤培养基，支原体可分解尿素，产生氨，使得PH值上升，培养基呈桃红色，进而证明有支原体生长。在半固体培养基中观察到沿接种线呈烟雾状，证明有支原体的生长；在固体培养基上可观察到“油煎荷包蛋”样状的菌落，中心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。
固体琼脂平板上形成的“油煎荷包蛋”样状的菌落（图片来源于网络）
指示细胞培养法（DNA染色法）
利用荧光试剂Hoechst33258标记细胞和支原体DNA，在紫外光（波长630nm）激发下产生黄绿色荧光。利用荧光显微镜观察支原体是否存在。正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光，胞质区无荧光。支原体污染细胞集中于胞质一级，可见荧光。荧光法的另一种方法是利用针对支原体的荧光标记抗体，与待检细胞孵育后，抗体与支原体结合，荧光显微镜下观察，支原体出现荧光亮点。
DNA染色法 （图片来源于网络）
支原体的核酸检测
核酸扩增检测技术（nucleic acid amplification technique，NAAT），其优点快速、便捷、受样本类型影响小，已成为实验室检测支原体污染的常用方法。支原体的核酸检测只要是基于聚合酶链发应（polymerase chain reaction，PCR），技术扩增支原体基因组中某段特异性核酸保守序列来判断是否有支原体污染。
NATT检测结果可以显示支原体基因组，但无法判断支原体是否存活，无法像培养法可以瓶判断支原体是否存活。也不能排除是否存在环境和/或试剂中的支原体核酸或质粒污染。且支原体种类繁多，设计扩增广谱性与特异性目的片段的PCR扩增引物存在某些不确定性，有假阴性的可能。所以基于PCR技术的支原体核酸检测不能代替“金标准”方法，但是其优势是可以作为细胞制剂的快速放行的检测方法。
BI支原体检测试剂盒检测结果图 （图片来源于网络）
支原体其他检测方法
支原体细胞膜有3层，厚度为7.5~10.0nm。内外2层主要成分是蛋白质和多糖，中间是脂质为主。Western blot技术通过检测支原体细胞膜蛋白，从而确定是否存在支原体污染。其缺点是耗时长、操作繁琐。其他的方法：放射自显影法、支原体RNA聚丙烯酰胺法、瓜氨酸测定法、酶联免疫吸附试验等支原体检测方法等。
控制和预防支原体的污染
1. 从可靠来源引进细胞。可从知名且信誉良好的专门机构购买细胞，如ATCC、基础医学细胞中心等，并有质检报告，提供细胞的无支原体的经检结果等其他信息。
2. 预防为主，无菌意识常有。细胞培养实验室应制定严格的管理制度，并按照规范的实验程序操作。
3. 早发现，早干预。定期对实验室的培养物进行支原体检测，确保实验顺利进行。
支原体检测试剂
EZ-PCR 支原体检测试剂盒（货号：20-700-20）是一种高灵敏度和特异性的基于PCR的检测方法，旨在检测细胞培养物和 其他生物材料中的各种支原体物种。该试剂盒包含优化的完整PCR混合物，包括多种支原体特异性引物、dNTP混合物和Taq聚合酶。借助EZ-PCR™ 支原体检测试剂盒的简单方案，只需几个小时即可获得准确的结果。
支原体检测试剂 （图片来源于网络）
支原体的处理试剂
| 产品名称 | 主要成分 | 产品货号 | 产品规格 |
| 支原体处理试剂1 | 太妙菌素 | C3470 | 10mL，20mL，100mL |
| 支原体处理试剂2 | 二甲胺四环素 | C3471 | 10mL，20mL，100mL |
| 支原体处理试剂3 | 环丙沙星 | C3472 | 10mL，20mL，100mL |
支原体杀除试剂使用方案：
为了给您提供更有效的清除支原体污染，VivaCell推出两款支原体杀除试剂使用方案，欢迎选购。
参考文献：[1]陈耐寒;撒亚莲.细胞制剂支原体检测方法概述[J].检验医学,2022,37(07):684-687.
• 往期精选
