表观遗传学研究离不开对内源蛋白与DNA相互作用的探索。随着新技术的开发，我们可使用多种方法进行分析。说到最“爆款”的技术，CUT&RUN当仁不让。自2017年问世以来，已出现在各大高IF的文章中。
虽然相较于ChIP，CUT&RUN不论从适用范围、操作难度还是数据质量上都有所优化，但使用过程中仍会存在许多问题，让科研人们抓耳挠腮，比如DNA文库背景高、beads结块、qPCR信号低...
为了保住大家的秀发，且看小P娓娓道来！
CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease)是一种用于研究内源蛋白质与DNA相互作用的新技术。它是在2017年由染色质研究领域的大牛Steven Henikoff实验室开发的。这个方法结合了抗体靶向和原位核酸酶剪切的优势，提供了一种高效且精准的方法来分析染色质蛋白结合位点。类似于ChIP，CUT&RUN也是利用抗体靶向染色质相关修饰和蛋白，但其具有所需细胞量更少、背景低、操作时间更短等多种优势。
*对于转录因子，建议测序深度25M reads
* Skene PJ et al. Elife (2017) 6:e21856.
跟ChIP的靶点覆盖范围类似，CUT&RUN也适用于研究组蛋白修饰、转录因子、染色质修饰酶以及其他DNA结合蛋白在基因组上的结合位点。
但跟ChIP不同的是，CUT&RUN是通过抗体靶向和核酸酶原位切割的方法，将目的蛋白结合的DNA从染色质上切割并释放出来。
CUT&RUN的主要步骤：细胞通透化——加入目的蛋白抗体（特异性的结合在目的蛋白处）——招募和protein A/G偶联的微球菌核酸酶(pA/G-MNase)——加入Ca2+激活MNase活性，切割目标区域的DNA——回收片段化的DNA——qPCR检测或NGS建库测序。
图1：CUT&RUN实验原理
那么接下来我们将详细讲解CUT&RUN的实验流程和相关细节，供各位老师参考：
收获细胞，并且进行细胞计数，推荐起始细胞数量0.5-50万个。用室温的wash buffer对细胞清洗两次后加入ConA beads，室温下温柔孵育5-10min，使细胞结合在beads上。
要点：
a. 在收获细胞这一步，我们推荐您使用温和的蛋白酶来使细胞从培养皿上脱落下来。这是因为细胞结合在beads上，是通过Concanavalin A (ConA) beads上的植物凝集素ConA与细胞膜表面的糖蛋白结合来实现的。所以您需要尽量避免使用胰酶等，对细胞膜表面糖蛋白有破坏的试剂，或者消化时间太久。对于组织样本也是一样的，应该尽量使用机械的方法将组织研磨成单细胞悬液。
b. 对于组织胰酶消化流式分选得到的细胞，我们强烈推荐您使用ChIP来代替CUT&RUN。因为胰酶将组织消化成单细胞后，细胞就无法被ConA的beads结合。如果得到的细胞数目够多的话，也可以尝试使用离心的方法做CUT&RUN，这样操作就会稍微有点复杂，对实验技巧的要求很高。
c. 为了尽量减少对细胞的压力和刺激，在添加抗体之前的所有步骤可以选择在室温下进行。同时，在wash buffer清洗离心并重悬的步骤中也需要轻柔的操作，避免DNA断裂。
在细胞和beads结合之后，将管子转移到磁力架上弃去上清，并加入适量抗体结合buffer重悬beads。按照1:100或者说明书推荐的浓度加入一抗，室温孵育2h或4℃孵育过夜。
要点：
a. 在细胞挂在beads上之后要尽快换体系，使细胞进入到抗体结合buffer中。这是因为一般抗体结合buffer中含有EDTA，可以螯合二价阳离子，快速停止代谢过程，抑制内源性DNase活性。这有助于保持原生染色质状态，并减少最终DNA文库的背景。
b. 在抗体孵育过程中遇到了ConA beads粘在离心管壁并且结块的问题。在这种情况下，建议使用PCR管子来代替1.5ml 离心管用于后续的binding实验，并且将digitonin的终浓度降低到0.01%，来减少结块。随后清洗步骤中的Dig-wash体积也减少到200 µL以下，同时在清洗过程中要非常小心的操作，避免丢失样品。同时注意轻柔操作。后续每一步清洗beads的过程中，减少用枪头重悬beads的次数，先用buffer润洗几次后，最后一次再用枪头重悬beads，这样可以最大程度减少beads挂到枪头上损失掉。
抗体孵育完成后，将管子转移到磁力架上弃去上清，并加入适当清洗溶液清洗2-3次，去除未结合到目的蛋白上的多余游离抗体。清洗完成后，用含有pA/G-MNase融合蛋白的溶液重悬ConA beads，孵育时间最短可以室温孵育10分钟，或者可以4℃孵育1个小时。这一步是为了使MNase通过其融合的protein A/G被抗体招募到目的蛋白结合处。
pA/G-MNase孵育完成后，将管子转移到磁力架上弃去上清，并加入适当清洗溶液清洗2-3次，去除没有结合到目的蛋白上的游离pA/G-MNase。清洗完成后，将管子放置在冰上，加入Ca2+激活结合到目的蛋白上的pA/G-MNase，使其可以切割目的蛋白结合的DNA，此步孵育反应在冰上进行。切割完成后加入反应终止液，并在37℃孵育30分钟，这是为了将被切割的DNA释放到上清中。随后将管子转移到磁力架上吸附，小心地将上清转移到新的离心管子中。这里就是目的蛋白结合的DNA，随后进行DNA进行纯化回收。
要点：
a. MNase只有在Ca2+存在的情况下才会有切割活性并且这种活性是低温度依赖的。在CUT&RUN实验中，在0℃即可使MNase切割释放靶蛋白结合的染色质，同时降低非特异性切割带来的背景，而在更高的温度下会导致非特异性切割，带来大量背景。所以这一步一定要注意温度的控制。
b. 在酶切反应完成加入反应终止液后，请务必注意轻柔操作，避免基因组DNA断裂释放到上清中。在片段化DNA释放完成之后请立刻将管子转移到磁力架上吸附beads，将上清转移到新的EP管中。
DNA纯化回收后，可以进行文库构建，然后送测序分析。对于太少的细胞，我们不太推荐做qPCR，因为起始细胞比较少，得到的目的DNA量非常低，qPCR循环数会非常高。
当细胞数量少于5万个以后，离心以后很难看到细胞沉淀。这时候操作一定要非常小心。首先要确保带盖子的离心管在离心机中朝向是确定的，这样才能知道沉淀应该处于离心管的什么位置。另外，为了防止细胞挂到侧壁上，可以在离心完之后，再旋转管子180°重新再离心一次。吸弃上清时可以稍微留10μL液体。
对于转录因子或其他染色质低丰度蛋白，我们推荐测序深度为25M reads；对于组蛋白修饰类的靶蛋白，测序深度达2M reads即可。
我们推荐使用0.5-50万个细胞来做CUT&RUN实验，且需使用已被验证可用于CUT&RUN的抗体。具体来说，对于组蛋白修饰，需要至少5千个细胞。对于转录因子来说，我们建议用50万个细胞，会比较保险。当然少至5-10万个细胞，也可以尝试，但可能得到的peak数可能会少一些。
图2：5000个细胞核组蛋白修饰检测结果对比
分别使用Active Motif，竞争对手E或竞争对手C的CUT&RUN试剂盒检测5,000个新鲜的K562细胞核的H3K4me3信号，Active Motif的CUT&RUN试剂盒得出的结果比竞争对手更可信。所用到的抗体：H3K4me3: Cat. No. 91263。
请确保一开始做实验使用的是活细胞，可以使用Coutess II等自动细胞计数或台盼蓝染色后用血细胞计数器显微镜下观察的方法检测细胞活率。
一般来说，为了确保得到的peak不是假阳性，我们是推荐做IgG对照的。但是如果是样本间peak的差异分析，也可以考虑省去IgG。另外，阴性对照 IgG 可以产生文库。
一般来讲能做ChIP或CUT&Tag的抗体可以用于CUT&RUN，特别是能做CUT&Tag的抗体基本都能用来做CUT&RUN，不过我们确实也发现过某些抗体做ChIP效果很好，但是CUT&RUN效果不太理想。首先建议使用Active Motif CUT&RUN验证抗体中列出的抗体进行CUT&RUN实验，如果没有合适的抗体可供选择，可以优先选择能做ChIP或CUT&Tag的抗体作为尝试。
我们推荐用细胞核进行实验，但是在有些情况下，靶向转录因子的细胞样品可得出更高的峰，详情见下图。
CUT&RUN检测500,000个K562细胞和500,000个K562细胞核中的SUZ12，细胞样品和细胞核样品得出的结果相似，第一栏是HEPG2细胞的ChIP-seq结果作为对照。所用到的抗体：SUZ12: Cat No. 39357。
以下列出的抗体已被发表用于CUT&RUN。
（↓上下滑动以查看全部↓）
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文章来源：AM表观遗传研究专家
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