纳米抗体，为什么大家都叫它“性能猛兽”？

自1975年小鼠杂交瘤技术问世以后，单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAbs)研究的发展突飞猛进，凭借特异性高、均一性好等特点，与传统从血清中提取的多克隆抗体（polyclonal antibodies，pAbs）形成了双雄对峙局面，二者实力不分伯仲，在不同的应用场景各有优劣。

随着时间推移，科学家发现不管是单、多克隆抗体，似乎都......太大了。150kDa左右的免疫球蛋白全抗对于愈发精细、准确的科学试验和药物研发而言，是一个不小的阻碍。空间位阻大、容易引起免疫反应、无法透过血脑屏障......弊端开始显现。

科学家开始寻找更小的抗体。

1988年，Skerra等科学家[1]首次运用基因工程技术设计并改造抗体基因结构，成功获得了功能性单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment，scFv)（下图）。scFv保留了识别与结合抗原的能力。并且丢掉了重链恒定区片段(Fc)，不仅免疫原性低，不与细胞膜上 Fc 受体结合，而且分子小(约25kDa)，可以穿过血脑屏障，大大扩展了抗体的应用前景。

图片来源于引用文献[11]

1989年，来自布鲁塞尔自由大学（VUB）的Hamers-Casterman等人[2]在一次实验中偶然发现，单峰驼血液中有相当数量的抗体缺失了轻链，为确保这个结果的准确性，该团队成员多次重复实验，结果依旧。单峰驼的血液中真实存在天然的轻链缺失抗体，也被称作重链抗体(heavy-chain antibodies，HcAbs)(下图)。

图片来源于引用文献[11]

HCAbs虽然丢失了轻链（原因有待探究），但其对抗原的识别能力仍在。HcAbs的重链可变区片段(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)以更小的躯体，发挥着传统抗体Fab段的完整作用。

1997 年，Ghahroudi等[4]利用噬菌体展示技术获得骆驼重链可变区片段VHH基因库，经多轮淘选后得到了只含有一个结构域的最小单元抗原结合片段，被称为单域抗体(single-domain antibodies，sdAbs)（上图）。这种椭球形的小分子抗体的直径仅2.5nm，长4nm，相对分子质量仅15kDa，是传统抗体的十分之一，因此也被称为纳米抗体(nanobodies，Nbs)。

纳米抗体作为已知的能够与抗原结合的最小功能单位，被视为最新一代的抗体工具，一颗冉冉升起的新星。在科学实验和抗体药物研发方面，除去高特异性、高亲和力等优点，纳米抗体还有着两个传统抗体不可比拟的优势：

1. 分子量小

分子量小是纳米抗体的立足之本。基于小分子量，纳米抗体在以下方面展现出优势：

(1) 穿透能力强。在生命科学研究方面，纳米抗体可以穿越细胞质膜，适合作为胞内抗体靶向胞内乃至核内蛋白，例如Chromotek®的一种特殊质粒Chromobodies®，可以用于实时监测胞内生化过程[5]；在医学研究方面，纳米抗体能够穿透血脑屏障（BBB），为大脑中疾病的研究及治疗提供新方法；同时也能从肾小球滤过，从血清中被清除，半衰期变短；并且纳米抗体还可进入致密组织内部，是靶向药物的理想材料[6]。

(2) 免疫原性弱。免疫原性与分子量及蛋白结构等有关，分子量越小免疫原性越小。纳米抗体分子量仅有传统抗体的1/10，因此刺激机体形成特异性抗体或引起体液和细胞免疫应答机率大大降低。同时，纳米抗体无Fc段，避免了Fc引起的补体反应，对人体免疫原性很低，生物相容性较好[7]。

(3) 空间位阻小。纳米抗体的小个头允许它结合到抗原的各个位置，包括一些凹陷的、不易暴露的表位，有助于提高抗体的特异性和亲和力；同时也允许一个抗原结合更多的纳米抗体，对生物信号有一个极强的放大作用,提高检测灵敏度；并且由于抗体大小导致的空间位移更小，所观测到的信号位置也会更加准确。此外空间位阻小也赋予纳米抗体辅助不稳定蛋白结晶的功能，2012年诺贝尔化学奖获得者因首次捕获到G蛋白偶联受体（GPCR）活化构象而获奖，其中的大功臣便是纳米抗体[8]。

使用Nano-Secondary®标记的HeLa细胞（左）和HeLa细胞内的波形蛋白（右）

(4) 可雕塑性强。纳米抗体作为一个15kDa左右的蛋白，分子量大小甚至远远小于咱们常用的GST标签（26kDa），因此纳米抗体的改造与融合也是相对容易的；还是以Chromotek®为例，他们基于纳米抗体开发出了一系列的产品：与磁珠或琼脂糖珠等基质相连，形成捕获蛋白的Nano-Trap系列；与GFP等荧光蛋白基因融合形成胞内探针Chromobody®系列；与AF488等荧光染料结合形成荧光探针Nano-Boosters & Nano-Labels系列......

(5) 表达纯化易。纳米抗体由单一基因编码、结构简单，是一个典型的β折叠桶（下图），适合于噬菌体、大肠杆菌、酵母等各种表达系统进行高效表达与纯化，并且获得的是具有生物活性的蛋白分子。

图片来源于引用文献[12]

2. 稳定性高

纳米抗体的另一个巨大优势便是它的稳定性。纳米抗体氨基酸序列相较于传统抗体的VH片段有四个关键位点的突变，使其亲水性增加，溶解性增加，不会像传统抗体一样容易出现聚集现象。