作为新一代RNA原位检测技术，RNAscope为代表的ACD检测产品为在FFPE、冰冻切片中检测各种RNA，包括mRNA、lncRNA、点突变、外显子跳跃等提供了高效的解决方案。由于采用了有别于传统RNA原位杂交技术的专利的探针设计，以及信号级联放大系统，ACD的RNAscope, Basescope, miRNAscope技术克服了由于RNA易遭受环境中随处存在的RNase降解导致的高信噪比，低敏感度的困难，从而解决了RNA原位检测的核心问题。
随着该项技术在国内的广泛推广，干细胞和发育领域，肿瘤及相关领域，传染病微生物研究领域等都在使用该项技术进行对应的研究。然而，骨及软骨样本由于其本身的特殊性，在国内进行RNA原位检测的应用相对较少。纵观国外相关文献，使用RNAscope技术在骨骼或软骨样本中进行RNA原位研究还是很常见。例如在发育类的研究中，2017年发表在J Clin Invest上的文章中[1]，有学者使用RNAscope 技术研究了Rnf146条件性敲除前后颅骨和牙齿发育过程中，Noggin和Shh mRNA的分布情况（见下图，箭头所指棕色信号点为RNAscope在颅骨和牙齿中检测到的RNA信号）。
另一篇2017年发表在Scientific Reports上的文章中[2] ，有学者研究了SHP2在胫骨生长板处软骨发育和成骨转化过程中的作用。通过使用RNAscope技术，研究者发现当SHP2阴性时，Col2a1 RNA阳性的软骨细胞增加，而成骨细胞包含的Mmp13, Runx2和Ctnnb1的RNA信号减少。提示SHP2对于软骨向成骨转换的重要作用（见下图，棕色信号点为RNAscope在软骨和成骨中检测到的对应基因的RNA信号）。
那么对于骨和软骨样本要做如何处理，才能够适用于RNA原位检测呢？以下是结合近期国内客户的部分结果，分享给大家的一些样本处理上的小贴士。
1. 骨和软骨样本固定：
对于骨和软骨样本，及时充分的固定是进行RNA原位检测的关键步骤。骨样本或者软骨样本取下后，第一时间进行充分固定，可以很好的保护样本内的RNA。固定充分时RNA和蛋白很好的交联在一起，可以防止被过度降解。一般对于骨和软骨样本，建议使用中性福尔马林固定液(10%,NBF)在约20 倍骨体积下固定24-48小时。
2. 骨和软骨样本脱钙：
由于骨和软骨样本本身存在钙成分，故脱钙是进行后期蜡块制备，切片的必要步骤。为了适用于RNA原位检测，选取合适的脱钙液十分重要。ACD公司的脱钙液以及国内某公司的一款快速脱钙液(Preserve脱钙液)已经被证实可以在很好的脱钙的同时保存骨样本内的RNA，以达到后期RNA原位检测的目的。两种脱钙液的区别在于前者温和但耗时较长（数周）；后者脱钙效力较强，时间较短（通常24小时内）。两种脱钙后的骨和软骨经验证RNA都能得到很好的保存。
脱钙时同样需要使用20倍组织体积的脱钙液，根据说明书推荐时间进行孵育。脱钙是否完全以使用镊子可以弯曲样本为标准。
注意：市面上的脱钙液种类较多，目前经客户反馈的一些其他种类的脱钙液使用后RNA保存效果不佳，故选择脱钙液时要谨慎。
3. 脱钙后步骤：
脱钙结束后要使用清水彻底冲洗样本约10分钟。之后如果制备石蜡块，则样本可以直接进入酒精脱水步骤。
如果制备冰冻样本，建议样本放入PBS浸泡1-2小时，之后放入4摄氏度的15%和30%蔗糖溶液直至样本沉入底部（该步操作可以有效保护组织形态）。之后取出样本用吸水纸蘸干外部水分后OCT包埋。
4. 结果例图
下图为国内客户提供的骨（左图）和软骨（右图）RNAscope检测结果例图。图中红色信号点为使用RNAscope 2.5 HD Red检测试剂盒检测的小鼠骨或软骨组织内Mm-Ppib的RNA信号（福尔马林固定24小时，Preserve脱钙液22小时处理的石蜡切片）。
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RNAscope技术
Basescope
References:
1. J Clin Invest. 2017;127(7):2612–2625. Ubiquitin ligase RNF146 coordinates bone dynamics and energy metabolism.
2. Sci Rep, 2017 Oct 5;7(1):12699. SHP2 Regulates the Osteogenic Fate of Growth Plate Hypertrophic Chondrocytes.
