图1 历年来 Ki-67 SCI文献发表情况（数据来源PubMed）
Ki-67是当之无愧的“靶点明星”，历年来都是科研人员关注的大热门（见图1），十余年来热度不减。病理报告通常上也都会有Ki-67指数这一项。那么Ki-67到底是啥呢？这个靶点又有何特别之处?目前的研究方向又有哪些呢？
本期我们将一一解答，更有Proteintech研发部技术老师针对该靶点的独门IHC、IF实验技巧分享。
Ki-67靶点，也被称MKI-67，在人类中是一种由MKi-67基因编码的分子量为345～395kDa的核蛋白。MKi-67基因是位于10q25-ter染色体上的一个连续序列，长度为29,965bp，由15个外显子（大小从 67到6845 bp）和14个内含子（大小从87到3569bp）组成[1-3]。
Ki-67于1983年在德国基尔（Kiel）大学的病理学系中首次被发现，对应的原始克隆编号为67，Ki-67由此而来。Ki-67蛋白结构如图所示，它可在细胞周期的所有所有活跃阶段（G1、S、G2和分裂期）表达，但在静息细胞（G0）中不表达[4]。在对Ki-67有了初步了解之后，让我们深入探讨它的功能以及与之相关的研究进展。
图2：Ki-67蛋白结构。图源：SWISS-MODEL
图3 Ki-67的功能（图源PMID: 29058263）
前面我们提到，Ki-67在细胞周期的所有非G0期（G1、S、G2和分裂期）表达，而在G0期缺失，该特点使得它非常适合作为细胞周期因子来研究细胞周期相关的问题。已有大量的研究揭示了Ki-67 在细胞周期调控、异染色质维持以及有丝分裂染色体上染色体周层的组装中的作用[5-7]。
Ki-67是有丝分裂染色体外围的一个组成部分，可在核膜解体后防止染色体塌缩为单个染色质团块，从而使染色体能够独立运动并与有丝分裂纺锤体有效相互作用[6]。此外，Ki-67含有与其他细胞周期调节相关蛋白相似的结构（如D53），推测其表达可能受蛋白水解途径调节，如由关键调节复合物细胞周期蛋白 B/细胞周期蛋白依赖性激酶2控制的途径[8-11]。
Ki-67的抗原分布也与细胞周期有关，G1期多分布于核仁周边区，S、G2期分布于整个核内尤其以核质区较为显著，M早期分布于染色体上，中期分布于染色体周围网状结构[12]。
图4 人类Ki-67 结构的示意图（图源PMID: 29322240）
A：Ki-67(NCBINP 002408)和RepoMan(NP 689775)的进化保守区域的比较。
FHA：叉头相关结构域；PP1：PP1结合结构域；CD：功能未知的保守结构域；LR：富含亮氨酸-精氨酸结构域
B：人类Ki-67(异构体Ⅰ)和RepoMan(异构体Ⅰ)的PP1结合域的主要序列的比较。
我们知道，Ki-67表达量与细胞周期紧密相关，由G1中期开始，从S期到G2期Ki-67的表达量开始增加，M期达到峰值，在M期后期迅速分解，且其半衰期极短，仅为1至1.5小时。这些特点使Ki-67成为目前检测细胞增殖活性最可靠的指标之一[13]。
Ki-67蛋白在恶性组织中的表达量明显高于正常组织，因此可将其用作肿瘤侵袭性的标志物[14,15]。其已被证实可作为乳腺癌、软组织癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌和中枢神经系统癌的可靠标志物[16-20]，尤其是乳腺癌的相关研究，是专家学者们关注的热点。
多家临床实验室已成功使用Ki-67作为诊断工具[21-24]。大量文献证明，肿瘤的发生发展、转移与Ki-67表达高度相关[26-29]。Ki-67表达率能够反映恶性肿瘤细胞的增殖潜能，Ki-67的表达率越高，肿瘤细胞增殖潜能越大，肿瘤细胞越容易发生侵袭和转移。
预后生物标志物是指用于确定具有相关疾病或医疗条件的患者的临床事件、疾病复发或疾病进展可能性的生物标志物。肿瘤细胞中Ki-67表达的变化可用作治疗效果的早期预测因子，并且可作为癌症患者长期预后因素[30]，如宫颈癌和子宫癌、非霍奇金淋巴瘤和大肠癌 [31][32]。
在许多癌症中，ki-67的表达量与良好的预后呈负相关[33]。但ki-67也不是判断预后的唯一因素，并非Ki-67值越高就意味着预后越差，在不同类型肿瘤中，Ki-67值高低代表的意义也不尽相同。如伯基特淋巴瘤的Ki-67指数很高，然而却有相对较高的治愈率。
所以，ki-67指数和预后的关系也要依据不同的肿瘤分型来综合考量。
已有研究表明，通过调节Ki-67的表达或活性，可以影响癌症的进展和治疗反应。Ki-67的中基化寡核苷酸能够有效地抑制肾癌细胞的增殖，同时诱导其凋亡[30]。
有研究人员用针对Ki-67的脂质体递送的肽核酸（Peptide Nucleic Acids，PNA)和Ki-67反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASOs）处理人类肾癌 786-0 细胞，发现抗Ki-67 PNA 在抑制肾癌细胞增殖和诱导细胞凋亡方面比 ASO 更有效[24]。此外，也有学者从RNA干扰(RNAi)、启动子控制的癌症基因治疗等方面探讨了Ki-67作为癌症治疗的潜力[13]。
Ki-67的实验关键点与它的特征紧密相关，其主要在增殖细胞的细胞核中表达，在有较强增殖活性的肿瘤组织中比较容易检测到。若不确定样本是否表达靶标蛋白，可通过阳性对照确认。我们通常推荐扁桃体作为阳性和阴性组织对照（见下图），同时，通过肝脏或胰腺作补充阴性组织对照。
通常我们可通过免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）、流式细胞术（FC）、ELISA等实验检测Ki-67的表达情况。其中IHC和IF应用最为常见，我们也重点和大家分享一下IHC和IF的检测要点。
在做Ki-67靶点检测时，大体上还是按照IHC通用流程来，通用流程可参考我们的实验技术手册IHC篇（点击蓝字即可下载）。需要关注的细节如下：
1. 石蜡切片脱蜡要彻底，否则会导致切片染色不均。
2. 组织切片要用Tris-EDTA（pH9.0）修复，可以充分暴露抗原决定簇。
3. 要用3%BSA封闭，降低非特异性染色的干扰。
4. 一抗一定要用抗体稀释液稀释，一是保证抗体稀释后仍能保持活性，二是可以降低非特异性染色引起的背景。
5. 二抗使用时注意对应的种属，避免加错二抗导致组织无着色。
6. 一抗和二抗的孵育温度要注意：一抗在室温条件下通常孵育1个小时，4°C是孵育过夜；二抗室温条件下通常孵育半小时 。
7. 洗液冲洗要彻底，否则会导致非特异性染色。
8. DAB原液要避光低温保存。DAB染色液通常是在染色前配制，配制好后立即使用，不可配制好后室温长时间放置，否则试剂会失效。
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一、石蜡切片组织荧光：
1. 石蜡要脱蜡彻底，不然会影响抗原抗体的结合；
2. 修复方式建议用Tris-EDTA（PH9.0），加热修复；
3. 封闭用动物血清，跟二抗种属来源一致，也可用3%BSA，降低非特异性背景；
4. 使用荧光二抗注意和一抗对应种属一致，多色共染实验时注意不同荧光素的激发光和发射光波段，勿使不同荧光之间相互干扰。
5. 一抗孵育条件：常温2小时，或者4℃过夜；
6. 荧光二抗孵育条件：常温1小时；
7. 冲洗一抗和二抗时，不可直接冲在组织上，应冲在组织边缘处，使洗液顺流在组织上；
8. 如果组织样本自发荧光过高，可使用淬灭自发荧光的试剂；
9. 封片时，盖玻片从一侧缓放在组织样本上，避免气泡产生。
二、细胞荧光：
1．细胞制样前，使细胞状态调至最佳状态，制样密度在60%-70%之间，细胞均匀分布在玻片上；
2．固定用的多聚甲醛应现配现用固定结束后充分洗净固定液；
3．一抗孵育条件：常温2小时，或者4℃过夜；
4．荧光二抗孵育条件：常温1小时；
5．封片时，盖玻片从一侧缓放载玻片上，避免气泡产生。
6．选择与荧光素相对应的荧光通道观察。
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上文展示的数据均使用的是我们的Ki-67重组兔单抗，其属于Uni-rAb™系列重组兔单克隆抗体，是Proteintech最新一代抗体产品。重组兔单抗基于ABCE™单个B细胞抗体发现技术平台而开发。该平台在体外实现重组单克隆抗体的稳定高表达，抗体高纯度，库存充足，且均经过了全内源性免疫学实验验证，能匹配真实应用场景。
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参考文献
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