看外泌体如何“有迹可循”

PKH67、PKH26染料可以稳定与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞示踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH67，PKH26具有更长的半衰期，特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。

1. PHK67标记外泌体免疫荧光成像

   Ren et al. Cell Biosci 2019 9:62-70

2. PKH67标记大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）

   Nagyova et al. In Vitro Cell.Dev.Biol. -Animal 2014 50: 656–663

3. PHK26标记外泌体免疫荧光成像（蓝色为DAPI标记）

   Feng et al. Traffic 2010 11: 675–687

DiO，DiD，DiI，DiR是一系列亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，具有消光系数高、淬灭常数高、激发态寿命短等特点。一旦进入细胞膜后，可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。荧光颜色区分明显：DiO（绿色荧光），DiD（红色荧光）和 DiR （深红色荧光），DiI（橙色荧光）。DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。

DiO是最常用的细胞膜荧光染料之一，呈现绿色荧光，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。

DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。

▲DiO标记肿瘤细胞来源外泌体（蓝色为Hoechst33342染色）

Tian et al. Biomaterials 2014 35: 2383-2390

FM 4-64染料是亲脂性、水溶性的苯乙烯类化合物，能与质膜及内膜细胞器特异结合后发出高强度的红色荧光。

图中FM 4-64标记的外泌体膜（红色）与DiO标记的外泌体膜（绿色）有显著的一致性。

DiD是DiI的衍生物，具有明显往红光迁移的激发和发射光谱，这一特性使其特别适合标记具显著自荧光效应的细胞或组织。DiD进入细胞后，染料在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞染色。

▲将DiD标记的外泌体与PC12细胞孵育3h后共聚焦观察

Tian et al. J Biol Chem. 2014 8: 22258-2267

▲成纤维细胞与CM-Dil染色标记的外泌体及对比未加入外泌体，共孵育24h后成像观察

Hu et al. Scientific Reports 2016, 6:32993-33003

▲DiI标记的外泌体注射入小鼠，第3、6和20天共聚焦观察，对比可以发现外泌体在皮质层发生了很大的迁移

Zheng et al. Neuroscience. 2017;9:12

DiR：近红外荧光的亲脂性花青染料，在标记细胞质膜时，DiR 的两个18-碳链插入到细胞膜，从而进行特定的、稳定的细胞染色，几乎不会发生细胞间的染料转移。

▲小鼠体内静脉注射DiR标记的外泌体，3h，6h，24h后进行成像观察

Manca et al. Scientific Reports 2018, 8:11321-11331

发表在《Nanoscale》上的一篇文章，通过将硫醇基团与荧光探针相连接，直接标记外泌体的外表面。以这种方式标记外泌体并不影响其大小，也不影响其诱导分化的能力。研究人员将经过修饰的外泌体添加到肺成纤维细胞中。他们证实，荧光标记的外泌体也能让成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，与未修饰的对应物一样有效。

▲Alexa488染料结合EV硫醇基团，与Hela细胞共孵育，共聚焦成像观察

Nanoscale 2017 9:13693-13706

羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE），是一种可穿过细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后，琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定且能用醛类固定的荧光偶联物。CFSE不影响细胞的增殖能力，不仅用于细胞增殖的体外实验,也可用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程。使用CFSE进行标记的外泌体可以用于后续FACS、NTA和显微镜观察使用。

▲DC细胞摄取CFSE标记的外泌体

Kastresana et al. Nat Protoc. 2012 7: 1311-1326

Calcein AM是在Calcein（钙黄绿素）的基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，能够轻易穿透细胞膜。当其进入到细胞后，酯酶会将其水解为Calcein（钙黄绿素）留在细胞内，发出强绿色荧光。Calcein AM的细胞毒性很低，Calcein（钙黄绿素）不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。

▲通过钙黄绿素染色的方法对外泌体完整性进行检测

Gray et al. MethodsX 2015 2:360-367

如果外泌体完整性很好，绿色荧光的钙黄绿素保留在外泌体中，若为膜碎片或其他碎片等，则钙黄绿素会泄漏出来，没有荧光。

Ag₂Se@Mn量子点一体化具有优良的近红外（NIR）荧光和磁共振（MR）成像能力，可用于微囊泡体内标记跟踪。是一种低毒高灵敏、非侵入性的实时活体成像的方法。

Ag₂Se@Mn量子点是通过控制Mn⁺与Ag₂Se纳米晶体在80℃的NaOH溶液反应制成，具有超小尺寸和良好的水分散性，能够通过电穿孔直接和有效地装入的微囊泡。可用于不同来源的微囊泡标记，对微囊泡损伤较小。

▲Ag₂Se@Mn通过电穿孔装入到MVs中(DOX QD-MV)中

Zhao et al. JACS 2016 138: 1893-1903

外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63，CD81和CD9）、热休克蛋白家族（HSP60，HSP70和HSP90），示踪病毒使用CD63或CD81作为生物标记，通过将CD63或CD81与荧光蛋白偶联，带荧光的膜蛋白会表达至外泌体膜上，便于后续进行、观察内化或其他实验。

将CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒包装到病毒中，再转染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。

▲CD63-GFP 标记外泌体示踪

Men et al. Nature Communications 2019 10: 4136-4153

对分离外泌体进行体外标记或体内示踪是研究外泌体功能必不可少的步骤，通过标记外泌体可以观察细胞对外泌体的摄取，以及外泌体分布到组织、器官中的变化。