嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞疗法作为治疗血液恶性肿瘤的新型手段，在近年取得了突破性的进展。2017年8月和10月已有两个 CAR-T 产品获得了美国 FDA 批准，分别用于难治性或二线治疗后复发的B细胞急性淋巴细胞白血病、特定类型的大B细胞淋巴瘤患者 (弥漫性大B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤)。
除了针对血液肿瘤，目前也有大量的研究工作围绕 CAR-T 在实体瘤中的应用，然而实体瘤中 CAR-T 的疗效不如在血液肿瘤中显著。比如在诺华生物研究所发表的 CAR-T-EGFRvIII 在复发性胶质母细胞瘤的研究报道中，CAR-T 治疗表现出一定的疗效，但所有的患者 (10例) 均发生了疾病进展。而在近期举办的美国癌症研究年会 (AACR) 上，贝勒医学院公布的数据显示，在 HER-2 阳性的复发难治性肉瘤患者中，靶向 CAR-T-HER2 相比曲妥珠单抗能更好的靶向低表达水平 HER2 的肿瘤细胞，但相比血液肿瘤中 CAR-T 疗法的出色数据，针对实体瘤的 CAR-T-HER2 治疗能力更为有限。
无论是 CAR-T 还是 TCR-T 疗法，由于肿瘤异质性以及微环境的复杂性，筛选更明确的治疗靶点、或优化不完善的靶点，以及克服肿瘤微环境中阻碍T细胞功能的障碍，对于实体瘤的治疗研究显得异常重要。
在选择实体瘤 CAR-T 治疗的新靶点时，需要对靶点的安全性进行评估，检测其在正常组织中的表达情况，以避免由于非肿瘤组织的在靶效应 (on-target/off-tumor) 引起严重的不良反应事件。此外，在组织环境下直接跟踪和监测 CAR+ T 细胞的药代动力学也至关重要的，有助于理解肿瘤外毒性和肿瘤杀伤效力的机制。同时检测肿瘤免疫检查点、药物靶点的情况，更有助于联合治疗。
2017年《Sci Transl Med》上，宾夕法尼亚大学和诺华生物研究所发表了针对 EGFRvIII 阳性的复发性胶质母细胞瘤患者使用单剂量 CAR-T-EGFRvIII 疗法的一期临床数据。数据表明，尽管静脉输注 CAR-T 可以在脑组织肿瘤区域形成有活性的在靶 (on target) 效应，但改善 CAR-T-EGFRvIII 在 GBM 中的治疗效果还需要克服局部肿瘤微环境的适应性变化并解决抗原异质性的问题。
在该研究中，他们应用 RNAscope®技术对 CAR-T-EGFRvIII 在肿瘤组织中的浸润情况和激活情况进行了分析：他们设计了特异性针对 CAR 载体 3’UTR 区的探针以及针对 IFNg mRNA 的 RNAscope® 探针，原位表征了受试患者肿瘤组织中 CART-EGFRvIII 浸润的程度，证明了激活的 CAR-T-EGFRvIII 细胞在输注后2周浸润至肿瘤区域。
在来自相同机构的另一项研究中，研究人员发现尽管 CAR-T 细胞对小鼠 FR-α 抗原治疗后肿瘤生长延迟，肿瘤最终呈指数增长，而这种对 CAR-T 治疗的逃逸可能是由于抗原表达的异质性，肿瘤区域存在着 FR-α 阴性肿瘤细胞。他们使用 RNAscope® Duplex 实验来同时检测 FR-α 和 CD3 在肿瘤区域表达，发现肿瘤的几个区域表达 FR-α 并含有大量 CD3 阳性T细胞，这表明尽管成功地侵染了肿瘤，但 FR-αCAR-T 细胞功能已经减退，这进一步揭示了肿瘤逃脱 CAR-T 细胞治疗的原因。此外，他们观察到 FR-α 抗原阴性的肿瘤细胞会表达 EGFR, 暗示着同时靶向 EGFR 和 FR-α 的联合治疗可能会更有效的避免肿瘤的免疫逃逸。
RNAscope® 原位杂交技术用于检测组织环境中基因表达的高特异性和单分子灵敏度使其成为评估“靶向/脱靶”基因表达的重要工具。针对 CAR 检测，RNAscope® 检测可直接针对 CAR 载体的非编码区 (UTR) 设计特异性识别探针，在动物模型或者患者的组织样本中可视化 CAR-T 细胞在各组织中的分布情况，以及针对肿瘤区域的浸润情况。此外 RNAscope® 检测也可以多通道同时检测 CAR，细胞因子，T细胞标记物和其他标记物，可视化 CAR-T 细胞在肿瘤组织的浸润和激活以及肿瘤组织的免疫微环境。
下面的数据为 ACD 公司应用 RNAscope® 技术在 RPMI-8226 异种移植小鼠模型评估两个候选 CAR-T 靶标 BCMA 和 ROR1 的抗原表达分布，以及追踪 CAR-T 细胞在组织中的分布和活化，以此说明 RNAscope® 技术如何应用于临床前研究，对 CAR-T 细胞效率和安全性/毒性进行评估。
● CAR-T 目标抗原表达和分布
对于 CAR-T 细胞靶标候选物 BCMA 和 ROR1， RNAscope® 检测显示 BCMA 仅在异种移植肿瘤和非小鼠器官中表达，而 ROR1 在小鼠肺和肝脏中以低水平表达，并在异种移植肿瘤中表达。
● CAR-T 细胞在组织中的分布和活化检测
为了检测组织环境中的 CAR+T 细胞，ACD 公司设计了靶向本研究中使用的 CAR 载体的 3'UTR 的特异性 RNAscope® 探针：
通过应用靶向 CAR 3'UTR 和 IFNG 或 GZMB 的探针进行 RNAscope®duplex 检测，发现表达 GZMB 或 IFNg 的 CAR-T-BCMA 细胞仅在异种移植肿瘤中浸润，而活化的 CAR-T-ROR1 细胞则主要在小鼠的肺部和肝部分布，在异种移植瘤区域分布极少。这和前面对 BCMA 及 ROR1 两个靶点在组织中分布情况的检测非常一致。CAR-T-ROR1 细胞在非肿瘤组织中具有活性，表明该靶点具有潜在毒性。相反，BCMA 仅在肿瘤中表达，而 CAR-T-BCMA 细胞仅在肿瘤中有活性。
RNAscope® 技术为组织环境中检测活化的 CAR-T 细胞以及低表达 CAR 靶抗原提供了一种快速、稳定的检测方法。即使候选抗原表达水平非常低，CAR-T 细胞也可能对其识别并被激活，引起“在靶/非肿瘤组织 (on-target/off-tumor)” 毒性而引起临床不良事件。
RNAscope® 检测可作为临床前 CAR-T 安全性评估和临床药代动力学工作流程之一：
● 检测动物模型和人类样品中所有正常组织的低水平基因表达。
● 评估正常组织中的细胞特异性靶点表达和肿瘤组织中的表达异质性。
● 可视化和量化肿瘤及非肿瘤组织中的CAR-T细胞浸润和活化情况。
● CAR / TCR载体、细胞因子、免疫细胞标记物或其他细胞类型标记物的同时检测。
RNAscope® ISH 技术是由 Bio-techne旗下 Advanced Cell Diagnostics (ACD) 公司研发的 RNA 原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的 RNA 原位杂交相比， RNAscope® ISH 技术属于新一代 RNA 原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链 RNA 探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标 RNA。
该技术优势如下：
应用广泛: 使用RNAscope® ISH 技术，靶点 RNA 为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而 RNAscope 技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。
特异性：RNAscope® 独特的双Z (ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要 2~4 周时间即可完成。
灵敏度：RNAscope® ISH 技术检测每个 RNA 分子时，只需三对双Z (ZZ) 探针即可完成杂交和信号可视化。
单分子可视化和单细胞定量: 使用 RNAscope® ISH 技术杂交上三对及以上双Z探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。
兼容降解的RNA: 由于仅利用三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。
检测结果稳定一致性：由于工业化合成 RNAscope® ISH 技术用到的探针以及所有检测试剂，且该技术针对不同样本类型 (冰冻切片，石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等) 已经有成熟的实验操作流程，故使得 RNAscope® ISH 技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在 Leica 以及罗氏 Ventana 自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。
多通道多靶点同时检测：由于 RNAscope® ISH 技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。
Reference:
1. O’Rourke DM, et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Sci Transl Med. 2017; 9(399): pii: eaaa0984.
2. Wing A, et al. Improving CART-cell therapy of solid tumors with oncolytic virus-driven production of a bispecifc T-cell engager. Cancer Immunol Res. 2018; 6(5):605–16.
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