RNAscope常见问题小贴士-问题样本预处理调整篇

如前所述，进行RNAscope检测时，样本尽量按照标准流程进行制备，尤其是固定步骤，以达到最佳的检测效果。然后有的时候由于种种原因，比如临床早期收集的珍贵样本未进行充分固定；某些传染病类样本为了避免潜在交叉传染故放在固定液中过久等原因，导致不得不使用未按标准进行制备的样本进行检测。这种时候根据固定的条件大致存在两种可能，即过固定（固定时间较长）以及固定不足（固定时间较短）。对照下图通常可以评估样本的固定属于哪类问题。即当组织块固定时间少于24小时（4%PFA的情况下也要考虑固定液是否为新鲜配制的有效固定液），通常会存在固定不足的问题(under fixed)；而当固定时间超出48小时，则会出现过固定问题（over fixed）。

针对于这类样本，可以在预处理条件上进行一定程度的调整，但是值得注意的是，并非进行了这类调整就一定会达到满意的效果。尤其是under fixed的样本，由于早期固定不充足，组织样本内的RNA未受到足够保护，已经发生了部分降解，故只能尝试进行以下推荐方法的预处理优化操作，以期达到较好的改善。在进行以下调整时，一定要同时进行阳性对照探针（Hs-PPIB或 Mm-Ppib等）以及阴性对照探针（DapB）的检测，缺一不可！

在进行调整时，样本第一次要按照标准预处理流程进行检测。以石蜡样本为例，即下图。

当RNAscope检测结果显现出消化过度时，则提示该样本固定不足（under fixed），这时，可以通过减少target retrieval的时间以及蛋白酶（protease）处理的时间进行调整。而当检测结果显示消化不足时，则提示样本为过固定（over fixed），这时需要通过增加target retrieval的时间以及蛋白酶（protease）处理的时间进行优化调节。

在正常标准制备的样本中，RNAscope检测到的阳性对照探针（Hs-PPIB）的信号和阴性对照探针的信号如下图所示。细胞核轮廓清晰，RNA点状信号清晰。

但是当固定不足的石蜡切片经过标准预处理（15分钟target retrieval以及30分钟蛋白酶）步骤后，会呈现出如下图结果。即细胞核轮廓不清晰（此图中的RNAscope的点状信号尚可）。

遇到这类情况，可以通过降低蛋白酶时间（30分钟）降到15分钟，或者将target retrieval 时间由15分钟降到10分钟甚至更短进行调整。下图为阴性对照探针的检测结果，该样本只进行了12小时的固定，故固定不足。当使用标准的15分钟target retrieval的时候，如左图所示，细胞核基本无法辨别其边界。但是当把target retrieval的时间降到8分钟后，细胞核结构出现了明显改进。

在另一个例子中（下图），同样是只进行了12小时固定的另一个固定不足的样本，当把target retrieval的时间从15分钟减到8分钟后，细胞和轮廓有了明显提升，而RNA信号点无明显影响甚至更加sharp。

在使用荧光检测试剂盒的检测中，同样存在这类问题。如下图所示，使用了阳性对照探针POLR2A/PPIB，对小鼠脑片进行检测。由于左侧过度消化导致红色的PPIB信号丢失，只有少量POLR2A的RNA信号点，且自发荧光背景较强；当进行了预处理调整后，右侧的脑片中两种对照探针的信号均可见，由于信号较强，故自发荧光已经通过曝光时间的减少而降低。

过固定样本在经过预处理后会显示出漂亮的细胞核形态，但是未见或少见阳性RNA信号点，如下图（左图为阳性对照探针，应该有阳性RNA信号点，但是此图由于样本过固定，未检测到阳性信号点）。此时可以通过延长target retrieval时间和蛋白酶时间进行调整优化。

而下图是使用24小时固定和3周固定样本，使用标准预处理进行的RNAscope检测，可以看到右图中信号点明显减少。故对于右侧这类过固定样本，也要通过延长target retrieval以及蛋白酶进行改进。

如前所述，以上的优化条件可以在一定程度上对未按照标准固定流程制备样本进行一些优化。但是操作时一定要阳性对照探针以及阴性对照探针同时进行同步调节。摸索到合适的条件后再进行后续靶探针的RNAscope检测。以避免由于过度预处理，导致的非特异性信号的检出，误导实验结果。

RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下：