针对不同的杂带和情况，有不同的处理方式。下面小P先分析产生原因，再用不同的方法处理。
IgG：阴性对照，Input：未经过免疫沉淀处理的全蛋白样品，Filtrate：IP过程中离心等步骤后的上清液（可能含有未被抗体-beads复合物捕获的蛋白质）
抗体本质是免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig），基本结构为Y型四肽链，由两条完全相同的重链（heavy chain，HC）和轻链（light chain，LC）组成。重链和轻链分子量（MW）分别约为50-75kDa和25kDa。它们之间通过二硫键相连，形成一个对称分子。
在WB检测制样步骤中，IP捕获抗体，在还原剂（如β巯基乙醇）和高温作用下，结构被破坏，二硫键断裂，抗体分解为重链和轻链。如果IP捕获抗体和WB检测抗体来源相同，这些变性后的重/轻链就会被常规Anti-IgG (H+L)酶标二抗识别，显影时出现重/轻链条带。
▲IgG抗体结构
①使用特殊二抗
A. 目的蛋白或互作蛋白分子量不在重/轻链附近时，选择常规二抗/构象特异二抗
B. 目的蛋白分子量在轻链附近，可选择构象特异二抗或抗重链特异性的二抗
IP：兔抗（10991-1-AP）
WB：兔抗（10991-1-AP）
抗重链特异性二抗：HRP-conjugated Mouse Anti-Heavy Chain of Rabbit IgG（货号：SA00001-7H）
C. 目的蛋白分子量在重链附近，选择抗轻链特异性的二抗
IP：兔抗（18121-1-AP）
WB：兔抗（18121-1-AP）
抗轻链特异性二抗：HRP-conjugated IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Rabbit IgG, Light Chain Specific（货号：SA00001-7L）
Tips：在使用鼠单抗时，由于其亚型较多，也可以针对鼠单抗亚型选择针对亚型的重/轻链特异性二抗，如：IgG2b鼠单抗（货号：60267-1-Ig），可以选择HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 2b Specific（货号：SA00012-3）。
也可选择HRP标记的Protein A作为二抗：
Protein A可结合IgG重链恒定区，在部分场景中可以替代重链二抗，发挥检测二抗的功能。
注：由于mouse IgG1与Protein A的亲和力较低，因此这种方法不适用于mouse IgG1类的抗体的检测
②使用HRP直标一抗作为WB检测抗体
不再需要二抗，因此不会出现二抗对IP产物中捕获抗体轻/重链的识别，不会出现“杂带”。但这种方法没有二抗放大信号，如果蛋白丰度不高，信号会比较弱。
③使用抗体偶联beads进行IP捕获
A. 传统抗体（来源于鼠/兔等）偶联beads，还是需要根据IP捕获抗体和WB检测一抗的类型进行二抗选择；
B. Nano-Trap纳米抗体，因其beads上偶联的纳米抗体来源于羊驼，无重轻链干扰，因此直接选择WB检测的一抗和普通二抗即可。
▲Nano-Trap示意图
（非实际条带，仅供参考）
Input条带单一，说明样本制备和WB检测没问题。IP结果有目的蛋白信号，说明IP抗体特异性较好。但IP结果和IgG对照条带较多/背景深，可能是抗体浓度高、beads非特异性结合、洗涤不彻底等因素造成的。
过多的抗体可能会增加非特异性结合的机会，同时也可能导致抗体自身聚集，从而在IP结果和IgG对照中出现多条杂带。
琼脂糖珠是多孔珠多聚体，类似于海绵结构，未被抗体覆盖的部分可能会结合可粘附的物质（如靶蛋白），非特异性结合引起高背景。
▲实心珠（左）和多孔珠（右）的示意图
洗涤步骤不彻底会导致未结合抗体和杂质残留，增加背景。
①抗体浓度高
通过梯度实验，确定合适的抗体浓度。可以从推荐浓度开始，进行倍比稀释，分别进行IP实验，观察条带情况，选择能得到清晰目标条带且杂带最少的抗体浓度。
②beads非特异性结合
在样本制备完成后IP步骤前，进行Lysate预处理：将样品先与不带抗体的介质（beads）进行孵育。与beads非特异结合的蛋白在此过程中被除去，不会与目标蛋白一起被洗脱下来。
Tips1：如果Lysate为IgG含量较高的组织样本，产物中大量IgG会干扰后续实验，建议不要省略Lysate预处理。
Tips2：核蛋白的非特异性结合都远大于细胞质蛋白，Nonidet P40（NP-40）可降低这种非特异性结合[1]。
③洗涤不彻底
• 增加NaCl浓度，降低由离子静电引起的相互作用
• 提高去垢剂浓度
• 增加洗涤次数和时长
• 针对不同的样品，需要通过实验对缓冲液的成分进行优化
Tips：Proteintech对比3种洗涤液（RIPA、PBS、TBST）发现：TBST（0.2%-tween）比较适中。RIPA稍剧烈，可能损失部分目的蛋白；PBS更温和，洗涤可能背景稍重。
IgG ctr：阴性对照，Input：未经过免疫沉淀处理的全蛋白样品
Input为未经过免疫沉淀的原始样本，含有目的蛋白，也含有其他蛋白。IP结果理论上只存在目的蛋白。
可能产生多条带的原因包括：①蛋白存在多种isoform；②样本制备时若未加入蛋白酶抑制剂，内源性蛋白酶导致样品降解；③样本存放时间较长；④抗体特异性不佳、非特异性结合；⑤WB检测抗体浓度过高
查阅文献或资料，确定目的蛋白是否存在多种isoform。或者检查制样过程，是否：①使用新鲜组织样本、②提取时保持低温、②裂解液中加入高质量的蛋白酶抑制剂、④制样后及时使用。如果仍条带较多，可考虑WB检测抗体浓度较高，提高稀释比；或者更换特异性好的抗体，例如Proteintech抗体。
小P总结了IP/Co-IP实验中可能出现杂带的原因和解决办法，可以参照下表进行排查和实验优化：
如果大家还遇到了上述文章中未描述到的情况，也可以在留言区或者私信小P讨论哦，小P会及时解答~
摆脱杂带干扰，选Nano-Trap就对啦！
特异性高、无重链和轻链干扰（普通WB检测抗体即可）、还有非特异性结合几率更低的磁珠/M-270磁珠可供选择。除此之外，该系列还具有亲和力高、抓取蛋白完全、30min基本捕获所有目的蛋白等等优点，不愧是IP金牌伴侣！
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参考文献
[1] Zeng X, Zeng WH, Zhou J, et al. Removal of nonspecific binding proteins is required in co-immunoprecipitation with nuclear proteins. Biotechniques. 2022 Dec;73(6):289-296.
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