Nature刊登遗传病分析重大进展
Target Sequencing
高通量测序技术已经被广泛用于疾病基因组特征和分子机制研究，研究策略无非是全基因组测序或是靶向测序，在靶向测序中，常见的靶向富集技术有PCR扩增目的区域或基于探针的靶向捕获技术，但这两种方法都很难绕过一个关键步骤－PCR扩增，使得研究人员无法对原始的基因组区域进行测序，从而无法保证测序结果的真实性和准确性；其次，由于目前大规模使用的二代测序技术短读长的限制，对重复序列扩增引起的疾病的分子机制研究存在巨大挑战。
近期《Nature》上发表了Parkinson’s Institute、Houston Methodist Research Institute等多个机构共同完成了六例同一家族中同样具有ATXN10基因重复扩增但具有不同临床表型成员进行深入的基因组特征分析。作者首次将无需PCR的CRISPR/Cas9靶向捕获技术与同样无需PCR的PacBio长读长、单分子实时测序（SMRT）技术完美结合，实现了从单碱基分辨率水平对完整的重复扩增区域（5.3～7kb）进行测序和分析，对ATXN10基因型与表型的关系进行深入研究，发现了新的遗传修饰因子，并初步解释了发生临床表型差异的原因。作者在文中特别指出：“对重复扩增区域进行完整测序，明确致病基因的遗传结构，这对于揭示遗传修饰因子与临床表型的关系具有重大的意义。我们利用单分子测序与CRISPR/Cas9捕获的组合方法成功地鉴定重复扩增的遗传组成，揭示帕金森病和ATXN10之间表型与ATXN10基因型的关联。”
10型脊髓小脑共济失调SCA10背景
SCA是一种临床上和遗传上异质性的神经退行性疾病，以小脑共济失调为主，但常常伴随着多种神经系统症状。如今已经确定，这些疾病是由重复扩增引起的，重复扩增的长度可能对发病年龄、严重程度或疾病进展有影响。其中，22号染色体上ATXN10基因中ATTCT五核苷酸的扩增是SCA10的起因。正常的重复范围在10-32个ATTCT。若重复次数在280-850，则疾病的外显率较低；若重复次数达到850-4500，则疾病完全外显，准确地判断重复次数对于疾病的判断非常关键。
本文所选家系特征
一个来自墨西哥家庭，兄弟姐妹中6人基因组皆具有ATXN10重复扩增，但具有不同的临床表型：
四名患者表现出10型脊髓小脑共济失调（SCA10）临床表型，伴随癫痫和渐进性痴呆等临床特征；
一名患者表现出共济失调及早发性左旋多巴反应性帕金森综合征；
一名家庭成员虽携带了大量的ATXN10重复扩增，但并未出现任何临床症状。
研究目的
期望通过遗传分析技术分析ATXN10基因的重复区域pattern，揭开临床表型差异的根本原因
主要研究方法
通过CRISPR/Cas9靶向捕获技术获得完整的ATXN10重复扩增序列，然后对富集产物进行PacBio SMRT测序。CRISPR/Cas9靶向富集过程如下：
图1：无需扩增的CRISPR/Cas9富集流程
测序结果
通过对富集得到ATXN10重复扩增序列进行完整测序，测序结果表明，四名SCA10患者ATTCT 发生480次重复，并同时具有920次ATTCC 重复干扰序列，该重复干扰序列占总重复扩增区域的60%. 而共济失调和帕金森临床症状的患者，具有大于1300次的ATTCT重复，但是不带有ATTCC这种遗传修饰因子，作者认为，这种ATTCC重复干扰序列可以作为一种遗传修饰因子，并推断该遗传修饰因子的缺乏也许在疾病过程中发挥作用，导致多巴反应性帕金森综合征的临床表现。具体ATXN10重复扩增序列pattern如下：
图2，PacBio对ATXN10完整重复扩增序列测序结果展示
原文信息：
Parkinson’s disease associated with pure ATXN10 repeat expansion
npj Parkinson's Disease 3, Article number: 27(2017)
doi:10.1038/s41531-017-0029-x
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