武装CAR-T，升级打怪

对于CAR-T开发者来说，除了选择合适的肿瘤抗原很重要以外，如何增强CAR-T细胞的增殖活性和杀伤活性也是多年来的一个研究重点。这期就来总结一下提高CAR-T活性的研究都有哪些。

CAR-T 的发展历史主要是围绕增强活性为主。CAR-T 1.0到CAR-T 3.0的变化主要体现在了CAR的胞内信号区。CAR-T 1.0只用CD3ζ信号链上的酪氨酸序列作为“信号1”来激活T细胞。而CAR-T 3.0则是在信号1的基础上加上了两个共刺激信号CD28和CD137，这不仅使其分裂活性获得提升，还促进了IL-2的合成与表达和抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌，从而抵消肿瘤细胞微环境带来的不利影响，但不影响其抗原特异性。

图1：CAR结构发展过程

Nature Reviews上面的一篇综述就总结了一些能提高CAR-T效果的方法。

图2 [1]：改善CAR-T治疗效果的方法总结。 a. 武装CAR-T细胞：T细胞不仅表达CAR，还会分泌IL-2来抵抗肿瘤微环境的抑制。b. 双受体CAR: 双受体CAR-T包含了识别肿瘤细胞抗原的CAR和把肿瘤细胞分泌的细胞因子转化成活化信号的CAR. c. 自然杀伤细胞（Natural killer cells, NK细胞）受体CAR: 把NK细胞的受体，如NKG2-D，整合到抗原识别域，可增强CAR-T细胞对正常细胞和肿瘤细胞的分辨能力。d. 阻断免疫检查点：来自于肿瘤微环境的免疫检查点信号PD-1或者CTLA‑4会对T细胞活性造成抑制作用。通过利用这两者的受体抗体就可以阻断其配体-受体的结合，削弱对T细胞的抑制。 e. 改善T细胞持久性：由于机体会对CAR衍生的外源多肽产生免疫反应，最终导致改造的免疫细胞的破坏。通过向胰腺癌病人回输两种不同靶向的CAR T细胞（一种识别CD19，一种识别mesothelin），其中CD19-CAR用来清除B细胞，从而阻止破坏mesothelin-CAR抗体的产生，最终改善CAR T细胞持久性。f. 靶向肿瘤血管细胞：血管生成素，如VEGF，会导致肿瘤的恶化与迁移。一些肿瘤基质细胞或者肿瘤细胞会大量表达VEGFR-2。一些临床前的研究表明，靶向VEGFR-2的CAR T可有效去除肿瘤基质细胞，但不会对正常细胞有影响。

可以看出，如何提高CAR-T增殖活性和杀伤力将继续是研究工作者们的一个重要主题。那通常评价CAR-T细胞的活性和杀伤力的方法都有哪些呢？

免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价过程都涉及到免疫细胞 (Effector) 和肿瘤细胞 (Target) 两种细胞存在，因此不能采取传统的细胞增殖活性检测手段 (如 MTT、ATP 等方法) 直接进行检测。需要采用其他标记手段。

EuTDA Cytotoxicity的检测原理与同位素 51Cr 释放的方法相似，通过特异性乙酰酯化的荧光探针BATDA标记 Target 肿瘤细胞，酯化的BATDA可穿透细胞膜随后被活细胞内的乙酰酯酶去乙酰化，去乙酰化的TDA 不能再次透过细胞膜而滞留的细胞内。然后洗涤离心去除多余染料，加入 Effector  免疫细胞，裂解后的 Target 肿瘤细胞将 TDA 释放到上清中，与时间分辨荧光探针 Eu 结合形成 Eu-TDA 复合物，最终通过检测该复合物的时间分辨荧光信号评价免疫细胞杀伤活性。

图3：EuTDA Cytotoxicity检测原理图

该方法具有更高的检测灵敏度，操作性、安全性及数据稳定性等方面也更有优势。EuTDA Cytotoxicity检测方法已被广泛应用于细胞杀伤活性评价，目前已有近千篇学术论文采用该检测方法。

ATP（三磷酸腺苷）是细胞活性的标志物，其仅存在于具有代谢活性的细胞内。由于萤光素酶和其底物 D-luciferin 反应需要ATP的存在才能产生光信号，其产生的化学发光信号同 ATP 含量成正比，因此可以通过检测发光强度反映细胞的代谢活性。PerkinElmer的ATPLite试剂盒是基于这个反应来达到高灵敏地检测细胞活性（最低 5 个细胞/孔），线性范围可达 5 个数量级，操作步骤简单，且信号稳定。无论是从灵敏度还是实验操作，都优于传统的MTT/XTT方法。

图4：生物发光反应

图8：ATPlite 1 step实验操作流程

参考文献：

 [1] Jackson, Hollie J., Sarwish Rafiq, and Renier J. Brentjens. "Driving CAR T-cells forward." Nature reviews Clinical oncology 13.6 (2016): 370.