良性成人家族性肌阵挛癫痫(Benign Adult Familial Myoclonic Epilepsy, BAFME)是一种常染色体显性遗传病,以肢体远端细微皮质肌阵挛样震颤(myoclonic tremor)和全面性强直-阵挛发作(generalized tonic-clonic seizure, GTCS)为特征,呈良性病程。
在近期发表于Journal of Human Genetics的研究中，研究人员应用PacBio SMRT测序技术，对一个来自日本患有良性成人家族性肌阵挛癫痫（BAFME）的家庭进行了全基因组测序，成功检测了常染色体中显性的家族性癫痫的致病性结构变异。作者通过低深度WGS数据（7X）进行筛选，锁定了含有6个SV的7.16 Mb大小的BAFME1基因区域，并精确定位了大约4.6 kb的SAMD12内含子的重复插入，这也是导致BAFME发生的原因。这些结果表明，长读长WGS可以有助于评估基因组中的所有已知的结构变异（Structural Variations，SV），并结合其他遗传方法鉴定出新的致病性SV，从而解决目前所无法解释的遗传疾病病因。
过去，对于致病性SV的筛选只能基于靶向序列对已知的SV进行检测。而如今PacBio长读长测序技术能够轻松读取平均最长超过10 kb的单分子DNA，同时具有无GC偏好性的特点，几乎能够完全覆盖大的SV。这种优势为检测以往所未知的SV以及重复扩增变异铺平了道路。
在这次研究中作者使用了SMRT测序技术v2版本试剂，在Sequel平台上采用6小时测序时间，对一名先证者和三名相关对照个体进行了测序。3个对照个体分别采用4个SMRT Cell进行测序，分别获得了6X，7X和8X的覆盖度的全基因组数据。第四个先证者个体采用10个SMRT Cell进行测序，得到了13X的覆盖度的数据（4-5Gb / SMRT cell）。
而如果采用最新Sequel System 6.0系统的v3版本试剂，使用10小时反应时间，预计每个SMRT Cell 产量还可以翻倍。
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图1：具有SAMD12致病性结构变异的家族谱系
在分析部分，研究人员使用PacBio专门开发的结构变异算法pbsv对所有个体测序结果中结构变异进行分析。在先证者测序结果中共检测到9138个插入和6498个缺失，在对照组中这一突变现象却并不存在；而之前人们对于这一基因相关突变的遗传分析更多的集中于已知的4个插入和2个缺失。
在全球大面积使用PacBio SMRT测序技术打造人类高质量参考基因组的今天，研究人员们还可以通过借助包含PacBio数据的公开数据库（例如Genome in a Bottle）作为参考，更加直接的缩小候选变异的范围。
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在最终获得的6个候选变异中，研究人员将重点锁定在了SAMD12内源性的4.6kb大小的五核苷酸重复扩增。插入片段的大小与Southern印迹实验中观察到的蛋白条带大小结果也保持一致。而在此之前也有相关报道称五核苷酸重复扩增可能是家族性癫痫的原因。
图2：使用pbsv对SMRT测序结果中的BAFME1基因SV分析结果
图3：通过Southern boltting验证SAMD12重复扩增
随着生命医学领域的研究不断深入，许多由于遗传原因而导致的疾病正在逐渐被人们所攻破，但仍存在许多未知遗传原因的疾病，这也从一方面说明现有的基于短读长测序计划在对于某些致病性基因变异的检测上的不足。短读长测序技术由于其技术限制对于中等以上长度的SV存在难以检出的问题，并且已有检测结果中还存在大量假阳性的问题。而随着研究的不断深入，基于长读长技术的新一代测序技术正在逐渐被应用于检测新型的SV上，并且获得了相比于短读取技术所不可比拟的巨大发现。
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近期PacBio Sequel System 6.0升级信息的发布，PacBio 单分子实时 SMRT测序技术更是革命性的为用户们带来了更高准确度的单分子reads。如今，SMRT测序技术已经能够获得Sanger测序质量，且最长平均酶读长可达100kb， 实现了“长读长”和“高准确度”兼得！高质量的测序技术将有助于我们了解关于生物学的更多信息。
原文信息：
Mizuguchi, T., et al. "Detecting a long insertion variant in SAMD12 by SMRT sequencing: implications of long-read whole-genome sequencing for repeat expansion diseases."
Journal of human genetics (2018).
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