收藏贴！抗体100问（五）丨染色质共沉淀- 大数跨境

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收藏贴！抗体100问（五）丨染色质共沉淀

基因快讯

2021-08-05

导读：CST技术支持团队精心总结

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Cell Signaling Technology（CST) 技术团队分类整理了客户最常咨询的问题（Frequent Questions & Answers），问题涉及#如何选择抗体 #抗原序列 #购买CST抗体的方法 #抗体验证 #WB、IP、IF、ChIP、CUT&RUN等实验应用的优化。

往期回顾：🔗第一期：抗体100问（一）

🔗第二期：抗体100问（二）

🔗第三期：免疫沉淀篇

🔗第四期：免疫荧光篇

第五期：Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）

如何下载ChIP或CUT&RUN中文版操作步骤？

1) 前往https://www.cellsignal.cn/，在“产品”搜索框中输入产品货号（例如9002S）, 然后按Enter。2）选择说明书；3）从菜单（Mac和PC）中选择“打印”；或4）选择“导出为PDF”；5）用您喜欢的短名保存。

你们的ChIP试剂盒（9002S，9003S，9004S，9005S，56383S）有什么区别？如何选择？

1） #9002和#9004是琼脂糖珠试剂盒，适合做ChIP-qPCR实验，不推荐做ChIP-Seq。#9003和#9005是磁珠试剂盒，既适合做ChIP-qPCR实验，又适合做ChIP-Seq。

2）相比#9002和#9003，#9004和#9005附有适合组织ChIP的操作步骤和试剂(价格也高一些)。

ChIP或CUT&RUN的部分组分用完了，可以单独购买吗？

很多ChIP和C&R试剂盒里的试剂都有独立或组合售卖，可以在CST网站找到。(ChIP related reagents，CUT&RUN related reagents) 若需要某试剂的大包装，请联系我们定制。

是否一定需要用无甲醇的甲醛固定细胞？

虽然很多人会顾虑甲醇对细胞的伤害，但在内部测试中，用含甲醇的甲醛与不含甲醇的甲醛进行ChIP实验，结果没有差异。故而我们内部测试时使用含甲醇的甲醛。另外，含甲醇的甲醛更稳定且经济。无甲醇的甲醛，我们推荐CST#12606，如果是含甲醇的甲醛，我们推荐Sigma F8775。使用前请确保甲醛未过期。

我可以用多聚甲醛固定吗？

PFA不是交联剂，如果用PFA做固定会导致实验失败。

超声操作方案中什么样的超声仪器最好用？

有三种主要的超声仪类型：探头式（接触式）、封闭震荡式 Biorupter（非接触式）、水浴式（非接触式）。根据诸多用户的反馈，Biorupter 相对来说最不适合做 ChIP 超声，因其 DNA 片段化效率低，长时间超声可能导致蛋白被破坏。探头式超声仪最便宜，而且 DNA 片段化效率高，因此我们推荐采用探头式超声仪来做 ChIP 的 DNA 片段化。水浴式（如 Covaris）也推荐使用，需要根据经验来摸索超声条件。

（超声法）我为什么超声很久，片段大小仍然没变化？

一般来说，过度交联可以导致染色质片段化出现问题，特别是在超声ChIP的过程中。我们一般建议用1%甲醛交联10分钟来处理培养细胞，不论靶标是什么。如果是组织样本，检测转录因子和辅因子，交联时间可延长至30分钟。另外一种可能是超声时细胞密度太高，我们建议细胞不超过20M/ml。如果超声细胞少于20M，可考虑缩小超声缓冲液的比例，以确保染色质样品的浓度恰当。

酶解法为什么还需要超声？

超声的目的在于破坏细胞膜和核膜，因为消化后的染色质仍在通透后的核内，所以需要使核内染色质释放到上清液中。超声时的缓冲液为1xChIP Buffer，该Buffer不是超声buffer，不会使染色质片段化。

（酶解法）每一步 buffer A和buffer B的作用？

1) 收集到的细胞用buffer A重悬，buffer A是细胞膜核膜 “打孔剂” ，以便核酸酶进入细胞核
2) 离心收集细胞核沉淀，用buffer B重悬（第一次），洗去残余的buffer A
3) 离心收集细胞核，用buffer B 重悬（第二次），提供最佳酶消化体系

（酶解法）超声的步骤是什么？我没有超声仪怎么办？

短暂超声处理 (20秒, 3次, 每次大于30秒间隔)，替代方法：Dounce匀浆器处理 20次，但破碎效果可能不完全。

酶解法酶的用量怎样根据细胞用量调整？

我们建议每400万细胞用0.5ul MNase，依照百万细胞增加或减少Mnase量。根据我们多年ChIP经验，这个比例适用于多种细胞系。如果您的细胞计数有系统性误差，可以参考ChIP步骤中附录A的流程优化，以确定每400万细胞的酶量（足够一次IP）。

对于转录因子和辅因子的ChIP，酶解法是否适用？

基于我们的实验经验，对于转录因子和辅因子，酶解法ChIP优于超声法。因为转录因子和辅因子的DNA结合能力相对较弱（相对于组蛋白），而超声法可能导致蛋白-DNA解离，甚至是DNA的降解，转录因子和辅因子的IP损失会导致结果假阴性。相比而言，酶解法就没有以上问题，所以能在转录因子/辅因子中产生可重复的较高的ChIP信号。

IP 级别的抗体能否用于 ChIP 实验？

ChIP 实验对抗体的要求高于 IP 实验。若使用未经过 ChIP 实验验证的 IP 级抗体进行 ChIP 实验，可能有低信号或高背景的问题。对于ChIP后的测序分析，是检测全基因组范围内的结合作用，因而需要更高级别的ChIP-seq抗体。可参考产品说明书。

ChIP的抗体用量是什么？

对于ChIP/ChIP-seq抗体，CST都会验证最佳稀释比，比如，抗体稀释度1:100的意思是，在500ul、含有10ug染色质的ChIP反应体系中加5ul抗体。注意：抗体与染色质的比例在ChIP实验中非常关键，抗体的量需根据DNA的量调节，而非ChIP反应的体积。

试剂盒中只有ProteinG的珠子，兔抗鼠抗都能用吗？

是的，protein G对兔、鼠、山羊IgG具有高亲和力。所以，我们的ChIP试剂盒（含proteinG 珠子）可以用于多种种属的商品化抗体。

ChIP 洗脱和解交联这两步都是65度进行的，可以合并步骤吗？

不建议将这两步合并。ChIP 洗脱过程中，抗体-染色质复合物会从 Protein G 微珠上洗脱下来，这步在恒温振荡混匀仪（Thermomixer）中以 1,200rpm 左右转速进行，较为剧烈。如果蛋白酶 K 在此时加入，原本共价偶联在微珠上的 Protein G 会被蛋白酶 K 消化，进而相应的降低蛋白酶 K 对抗体-染色质复合物的消化效率。同时，Protein G 上非特异结合的 DNA 也可能被更多的洗脱在溶液中，造成可能的背景信号升高。

我得到结果信号很低，为什么？

1) 抗体用量是否合适？
2) 抗体是否已经验证过能做ChIP？

3) 染色质用量是否合适？一般建议：
Histone (PTM): 2.5-5 ug
TF: 5-8 ug
Cofactor: 10 ug
4) 染色质质量如何？片段大小是否集中在150-500bp?

我得到结果IgG背景很高，为什么？

1) 洗涤不充分

2) IgG的用量是否不合适？（与一抗等量）
3) 阴性位点选取是否合适？
4) PCR体系是否污染？
5) 引物特异性问题
6) 常规PCR循环数是否过度？
7) qPCR计算方法是否合适？

ChIP-seq 与 ChIP-qPCR 检测方法如何选择？

ChIP-seq 关注的是基因组或者染色体组上的整体信息，而 qPCR 关注某些基因位点的特定信息，在做昂贵的 ChIP-seq 之前，往往需要先用 qPCR 对ChIP-DNA样本进行质控。

如果通过qPCR的方法检测实验结果，如何做标准曲线，判断扩增效率？

连续稀释用于qPCR反应的2％ input染色质DNA（未稀释，1：5、1：25、1：125）。使用Log10（％Input）作为X轴,Ct值作为Y轴绘制标准曲线。PCR效率=（10 ^（-1 /斜率）-1）* 100％。我们预计PCR效率在85％-115％之间。

酶解后未纯化/纯化后，染色质浓度已经极低（ChIP前），如何优化？（细胞已经用足量）

染色质DNA的浓度低提示了染色质抽提失败，染色质浓度低是由于细胞活力不够或染色质制备中有实验错误。我们建议不要用浓度过低的染色质DNA做ChIP实验，联系CST技术支持做问题排查。

选择琼脂糖珠还是磁珠？

磁珠的优点是在洗涤步骤中无需离心，这样可以减少时间，减少吸出磁珠的机会。磁珠做IP结果通常也具有较低的背景。此外，磁珠试剂盒（货号#9003、#9005和#56383）与ChIP-seq兼容，而包裹在琼脂糖珠上的精子DNA（用于减少非特异性结合）可能会污染您的ChIP-seq样品。因此，如果要进行ChIP-PCR，则磁珠或琼脂糖珠都可以。但是，如果您要进行ChIP-seq，我们仅建议您使用磁珠。需要使用磁力架来沉淀磁珠，您可以在我们的网站上购买（货号＃7017或#14654）。