精准长读长Iso-seq测序，深挖小胶质细胞与神经退行性疾病隐秘联系

人类小胶质细胞全长RNA测序鉴定新型异构体

研究人员使用PacBio全长转录组测序（Iso-Seq）方法对30个人类大脑进行检测，涵盖阿尔茨海默病、路易体痴呆症等，构建了以异构体为核心的小胶质细胞基因组图谱（isoMiGA，图1）。

鉴定出了35,879种新型小胶质细胞异构体（35,879/128,436，约1/3）及2,238个新基因（图2a）。还发现了非编码调控异构体的新类别，比如731种基因间异构体、621种反义异构体、326种位于已知基因内含子内的基因内异构体以及1,725种融合转录本。对于研究较为充分的阿尔茨海默病风险基因TREM2（图 2f）以及最近发现的与大脑衰老相关的RNA结合蛋白——异质核糖核蛋白K基因HNRNPK（图2e），研究人员观察到了多种融合异构体：

• 在 isoMiGA 中，HNRNPK基因中第5外显子和第6外显子之间存在一种新型的内含子保留事件，从而在经典的第6外显子编码结构域的上游产生了一个新的起始密码子。研究人员发现了两条支持经典的第 5-6 外显子剪接的肽段，以及两条支持新型上游起始位点的新型肽段（图 2e）。

• 在isoMiGA中，TREM2/TREML1区域有12种可检测到的异构体，其中4种是新的融合转录本（MSTRG.54710.2、MSTRG.54710.4、MSTRG.54710.5、MSTRG.54710.6，图2f）。

进一步评估每种异构体潜在的蛋白质编码能力，发现非完全剪接匹配（incomplete splice match）异构体中，预测具有蛋白质编码能力的异构体比例最高（82%，图2c），其次是目录中的新（novel in catalog）异构体（57%）。其他大多数转录本类型被预测为非编码型，或者对无义介导的mRNA衰变（NMD）机制敏感。

结合GENCODE v38 版本中注释的全部235,559种异构体、三项已发表的555份小胶质细胞短读长RNA测序数据以及为本研究新生成的另外121份样本短读长数据，对所有30个长读长RNA测序样本中35,879种新型异构体的表达进行了量化，观察到在长读长数据中发现的基因有93%是蛋白质编码基因或长链非编码 RNA（lncRNA）。当每百万转录本数（TPM）>0.1，有少数异构体（1,416种）在GENCODE中发现但未在长读长数据中出现，不过仅在GENCODE中存在的基因中有43%是非聚腺苷酸化的RNA种类，如微小RNA（microRNA）和小核仁RNA。而在常见阈值TPM > 1的情况下，未在长读长测序中检测到的仅在GENCODE中存在的异构体中，只有少数（14%）在短读长RNA测序样本中表达。这表明，虽然长读长RNA测序没有捕获到小胶质细胞中所有的转录本，但捕获到了绝大多数。令人惊讶的是，新型异构体的表达水平比已注释异构体更高，只有反义异构体的表达水平较低。

新型异构体在炎症刺激反应和脑区特异性方面表现出差异

研究人员分别用脂多糖（LPS）或干扰素γ（IFN-γ）处理诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞（iMGLs，在富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因中携带与帕金森病相关的突变（G2019S））24小时，以分别模拟对细菌或病毒感染的反应（图3a）。评估其差异表达情况，确定了部分新型基因和异构体对IFN - γ或LPS刺激有响应（图3b），其中包括TREML1 + TREM2通读融合异构体。

并且发现大脑皮质和非皮质区域的小胶质细胞之间存在广泛的脑区特异性基因的差异表达和新型异构体的差异表达（图3d）。脑室下区（SVZ）与其它脑区的小胶质细胞相比，有87种新的差异表达的基因（图3e）和3,125种差异表达的新型异构体（图3g）。这其中包括阿尔茨海默病风险基因PICALM，该基因有4种异构体存在差异使用情况，其中新型蛋白质编码异构体MSTRG.12300.16缺少上游的3个编码外显子，相对于其他异构体，它在脑室下区小胶质细胞中被下调。

新型异构体有助于发现剪接数量性状位点及解释与GWAS的新共定位关系

研究人员将新型异构体转录参考数据扩充到GENCODE参考数据中，增加了转录本使用和剪接事件的QTL发现率，确定了456个具有基因表达数量性状位点（eQTL）的新型基因和 5658 个具有转录本使用定量性状基因座（tuQTLs）的新型异构体。并且，新型异构体还解释了与GWAS的新共定位关系，在阿尔茨海默病（图4）和帕金森病（图5）中发现多个风险基因座与QTL的共定位。