革新mRNA加帽工艺：基因有限公司携手NEB推出高效加帽酶与检测方案

作者：Nicole Kelesoglu

Faustovirus 加帽酶（FCE）（NEB #M2081）是一种新型加帽酶，在 mRNA 生产中具备以下几个优势：与 VCE 相比，FCE 具有更高的加帽活性，因此在 mRNA 规模化生产中更具成本优势。FCE 可以与 mRNA 帽结构 2'-O-甲基转移酶在一步反应中同时使用。FCE 不但具有更高加帽效率，它对于某些挑战性的 mRNA 底物也有很好的加帽效果。

NEB 研究人员在最近发表的文章中分享了 FCE 的特性 “Biochemical characterization of mRNA capping enzyme from Faustovirus”，这些特性使其成为酶促 mRNA 加帽的首选推荐，尤其是在因 mRNA序列结构（如 5′ 序列）影响 VCE 加帽效果的情况下。FCE 的另一个优势是其在更广泛的温度范围内具有稳定活性。它可以实现低温加帽，以避免长片段 RNA 分子的降解；也可以实现高温加帽，以提高具有更复杂二级结构 RNA 分子的加帽效率。即使您已经非常熟悉 VCE，但鉴于 FCE 的非凡特性，非常值得测试比较这两种加帽酶。

液相色谱-质谱联用（LC-MS）是 mRNA 5' 帽结构分析的金标准，但这种方法有一定的局限性。NEB 设计了一种更简单、更优化的创新分析方法，该方法使用了 RNase 4。

基于 LC-MS 的 mRNA 5' 帽结构分析包含多个步骤。第一步是从合成 mRNA 中切割一段预期的 5' 片段，使其大小适合 LC-MS 分析。常规方法是使用 RNase H（NEB #M0297）、热稳定 RNase H（NEB #M0523）、DNA 酶。为了实现高效和精确的 RNA 切割，需要在切割位点选择上进行大量的研究测试。NEB 的科学家最近开发了一种使用 RNase 4 进行 mRNA 5' 帽结构分析的方法，无需繁琐的切割位点选择，极大简化了实验过程。此外，我们发现 RNase 4 耐受多种核苷酸修饰，使其成为含修饰核苷酸 RNA 的首选。您可以在 NEB 发表的这篇文章中了解具体实验方案：Selective Characterization of mRNA 5' End-Capping by DNA Probe-Directed Enrichment with Site-Specific Endoribonucleases.

在 RNase 4（NEB #M1284）产品网页上可以查看基于 DNA 探针引导的 mRNA 5'帽结构分析的实验方案 “DNA probe-directed analysis of mRNA 5′ cap structures”。使用 RNase 4 进行 RNA 帽分析将推进 mRNA 治疗的研究和开发。

图 1：使用 RNase 4 和普通 DNA 探针简化了基于 LC-MS/MS 的 5' 端 mRNA 加帽分析过程，无需 RNase H 切割所需的 DNA-RNA 嵌合探针

图 2：通过与 DNA 探针杂交并用 RNase 4 消化后，可以通过 LC-MS/MS 进行 mRNA 加帽分析。RNase 4 的切割位点更灵活性、更特异。