SMRT Leiden Day 3：结构变异，扩增子和全长转录组

最近PacBio 在荷兰 莱顿大学举行的SMRT Leiden大会顺利结束了。

这是SMRT Leiden第三天关于结构变异，扩增子 和 全长转录组的中文手记 。

详细内容请参阅 Elizabeth Tseng的Medium Blog（1）.

1 - 人类结构变异 大规模群组研究

演讲者：Fritz Sedlazeck

机构：Baylor College of Medicine 贝勒医学院

摘要：

Fritz Sedlazeck博士分享了他使用PacBio SMRT测序，并结合其他测序技术，对人类结构变异进行大规模群组研究。

- 改进样本制库技术对人类结构变异大规模群组研究极其重要。

- DNA样本的质量决定了10X测序的结果，而PacBio SMRT测序对质量不同的DNA样本有鲁棒性，生成较为一致的结果。

- 结构变异检测软件

-- SVCollector（2）

-- CrossStitch（3）

-- NGMLR（4）

-- Sniffles（5)

-- SURVIVOR（6）

-- Clairvoyante（7）

Fritz Sedlazeck博士也分享了他关于长读取测序的综述文章：Piercing the dark matter: bioinformatics of long-range sequencing and mapping（8）

2 - SVIM

演讲者：David Heller

机构：Max Planck，Germany （德国 马克思 普朗克研究院）

摘要：David Heller博士展示SVIM（9），一种基于图的，从低覆盖度测序数据 中 提取高准确度的结构变异结果的方法。

3 - 靶向测序

演讲者： Adam Ameur 

机构：SciLifeLab，Sweden （瑞士 科学生命实验室）

参考文献：

- Cavelier et al. “Clonal distribution of BCR-ABL1 mutations and splice isoforms by single-molecule long-read RNA sequencing”. BMC Cancer (2015)（10）

- Lodé et al. “Single-molecule DNA sequencing of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes with multiple TP53 alterations”. Haematologicahaematol. (2017)（11）

- Tsai et al. “Amplification-free, CRISPR-Cas9 Targeted Enrichment and SMRT Sequencing of Repeat-Expansion Disease Causative Genomic Regions”, biorxiv (2017)（12）

- Ameur et al. “De novo assembly of two Swedish genomes reveals missing segments from the human GRCh38 reference and improves variant calling of population-scale sequencing data”, biorxiv (2017)（13）

Adam Ameur博士介绍了如何使用靶向SMRT测序解决多种问题。

例一 - 融合基因 BCR-ABL1 是治疗 慢性粒细胞性白血病 药物的靶向基因。传统方式使用PCR和Sanger测序，无法精确的探测低频变异，有PCR偏差，也无法得到转录子亚型的全貌。他们采用PacBio Iso-Seq全长转录组测序来取代传统的Sanger筛查。

例二 - 用混合probes对TP53基因变异进行靶向捕获

例三 - 使用滚环扩增Rolling Circle Amplification（RCA）对HPV人类乳头瘤病毒基因组测序。

例四 - 和PacBio合作研发使用CRISPR/CAS9基因编辑（14）技术 进行 无PCR，无扩增的测序。

例五 - 介绍了Samplix（15）公司的微流体液滴富增技术Xdrop，以及用该技术来研究HPV18病毒与人类基因组整合作用。

4 - PacBio Demultiplexing 工具

演讲人：Armin Toepfer

机构： PacBio

辅助文献：Armin SMRTLeiden LIMA（16）

摘要：

       Armin Toepfer博士介绍了PacBio新一代的demultiplexing工具LIMA（17）。LIMA可支持四种不同方式的Barcoding样本制库，在Symmetric Barcode模式支持多达384种样本，在Asymmetric Barcode模式支持多达384x384约14万种样本。SMRT Link 5.1内置支持LIMA。

5 - Iso-Seq

演讲人： Richard Kuo

机构：Roslin Institute, University of Ediburgh (爱丁堡大学）

辅助文献：Richard Kuo SMRTLeiden（18）

摘要：

       Richard Kuo介绍了研发的归一化cDNA制库技术：5' cap trap and normalization。这种归一化制库技术能检测更多低丰度的转录子亚型，尤其是稀有的长链非编码RNA（lncRNAs）。

       Richard Kuo也介绍了Iso-Seq后续处理分析软件TAMA，以辅助合并二代测序RNA-seq数据，分析DNA ORFs和NMDs。

       最后Elizabeth Tseng博士与SMRTLeiden Iso-Seq与会者们进行了广泛的讨论，包括：

- 单细胞Iso-Seq测序的研发和制库优化，

- 动植物Iso-Seq

- 池化样本制库和分析

- 使用UMIs帮助识别缺陷读取和量化分析。