文库制备篇：建出高质量测序文库的小技巧

师妹怎么愁眉苦脸？

上次抽的RNA去做了建库和二代测序，拿到的数据量不正常，分析结果也不好，说是我文库没有建好，被老板一顿臭骂。要怎么才能建出高质量的NGS文库呢？

你的RNA质量怎么样？

浓度符合试剂盒的要求，大部分样本RNA Integrity Number (RIN)超过7，不过有几个RIN在5-6之间。

这就是问题所在了。RIN<7代表着RNA出现降解。用降解的RNA建库，捕获到的就只有3’端的部分了，一来丢失的信息太多，二来还会造成碱基的不平衡，建出来的文库质量也不好。

那我降解的RNA要怎么办？

来自人、大小鼠的降解的RNA可以用NEBNext rRNA depletion kit去掉95%以上的rRNA，留下的mRNA和lncRNA用于后续的文库构建。FFPE样本想要做RNA-seq就只能用这个试剂盒做处理。之后再根据RNA降解的情况来调整打断时间。另外，如果是来自FFPE样本的DNA建库的话，事前最好还要用NEBNext FFPE DNA修复混合液处理一下，可以修复胞嘧啶脱氨、切刻缺口、氧化的碱基以及被封闭的3’端。

为什么要调整打断时间呢？

这是为了让文库中的插入片段大小与测序模式相匹配。比如测序模式为Pair End 150(PE150)时，两端加起来一共可以读到300bp，那么核酸打断到300bp左右最佳。插入的片段越长，文库的生长效率越差，获得的数据量容易偏少；插入的片段过短的话，因为小片段扩增容易，加剧了PCR bias，最后引起PCR产物复杂度降低，重复率升高，而且测序结果中接头序列的比例会太高，造成数据的浪费。

原来如此。做数据分析的师兄说我的接头序列的比例有40%，让我优化实验，原来要从调整插入片段的长度入手啊。

另外，构建文库的时候还要注意避免接头二聚体和过度扩增。

这两个又是什么意思？

你看这张图，圈出来的125bp左右的尖峰就是接头二聚体，一般是因为接头与插入片段的连接效率不好。二聚体能与测序的流动槽结合，中间又不含插入片段，所以不会有数据产出，典型的占着茅坑不拉[哔——]。试试NEBNext的U型接头吧，独特的发夹状结构能够保证接头与插入片段的连接效率，极大地减少接头二聚体的产生，比自己合成的好用多了，而且DNA、RNA文库都能用。

那过度扩增呢？

文库右侧出现的额外的峰就是典型的过度扩增了，表明PCR的循环数太多。为了减少PCR bias和重复率，提高文库的复杂度，我们也应该尽可能降低PCR的循环数。NEB Q5聚合酶保真度超高，错配率不超过1/220万，无论模板的GC含量高低都有卓越表现，常规的RNA-seq建库只需要PCR 8个循环，有效防止过度扩增。

还有其他要注意的事项吗？

其他都是小细节了，比如实验前用核酸酶去除剂清理实验台和枪，保证环境干净，无气溶胶污染；磁珠洗涤的时候要严谨，转移上清的时候不要吸到磁珠；尽量使用低吸附的耗材，避免核酸被吸附在枪头或PCR管壁上造成无谓的损失等等。顺带一提，Geneplastix的低吸附枪头品质好，价格也实惠。