秘籍-No.2∣您的探针法qPCR为什么没信号？

当然可能是设计的问题，或者是探针生产质量的问题。这个好解决，参见我们上一篇秘籍即可。

排除了这些原因，那么就不得不考虑序列以外的高级技巧了：

探针的杂交能力！【敲黑板！！】

探针的本质是单链的核酸（一般是DNA）。在同样环境中（温度、buffer、浓度等），衡量核酸杂交状态的主要指标就是Tm值。Tm的定义为双链解链一半的温度。也就是说Tm越高的单链DNA，越容易与模板维持双链状态（即杂交）。

那么，如何提高探针的Tm值、提升其杂交能力呢？！

我们可以从美国FDA的官网找到线索。其官网上一个关于5色qPCR试剂盒的说明中，透露了他的秘诀：BHQplus探针！

——为什么FDA要在其推荐的探针组里，‘偷偷’混入几个BHQplus探针？

——传说中的BHQ升级了吗？不是！淬灭基团还是经典的BHQ，升级的是每一个嘧啶碱基！

你没看错！的确是所~有~的C和T都做了升级，通过对嘧啶碱基进行修饰，每一个C提升Tm 1度，每一个T提升Tm 0.5度。常规20bp的探针如果有50%的C\T含量，Tm提升可达5~10度！很大的增强了同样条件下探针的结合能力！

怎么，你不信？咱们看数据：

更重要的是，这种基于碱基互补配对原则的结合力提升技术，并不会很贵哟！

最重要的是，设计其实更简单哟！

正因如此，BHQplus技术尤其在技术壁垒较高的传染病领域¹和肿瘤领域²´³备受欢迎。

Source:

1.https://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/30874/On-the-Set-of-Making-of-the-Swine-Flu-Test-Kit-Inside-Biosearch-Technologies

2.Yeo J, Crawford EL, Blomquist TM, Stanoszek LM, Dannemiller RE, et al. (2014) A Multiplex Two-Color Real-Time PCR Method for Quality-Controlled Molecular Diagnostic Testing of FFPE Samples. 

3.A practical molecular assay to predict survival in resected non-squamous, non-small-cell lung cancer: development and international validation studies

The Lancet, Early Online Publication, 27 January 2012 doi:10.1016/S0140-6736(11)61941-7.