收藏贴！抗体100问（二）

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WB实验时，为何要设置阳性对照？如何选择合适的阳性对照？ 

使用已知的阳性对照样品对于确保Western Blot实验正常工作是至关重要的。推荐的对照样本可见CST产品网页的结果图。CST还在🔗网页（https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/control-treatments-by-target）中列出了针对我们许多产品的推荐对照样本。    

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WB样本裂解时，为何要超声？如何超声？如果没有超声仪，有什么替代方法？ 

无论使用何种裂解液，CST始终建议采用超声处理来确保彻底裂解和蛋白质提取。超声处理对确保染色质和膜结合蛋白的有效提取至关重要。它也能起到剪切染色质的作用，染色质可能会干扰SDS-PAGE胶的电泳。

推荐在冰上用超声探头（15W 3×5秒脉冲)对裂解的样本进行超声，替代的方法有玻璃珠涡旋，或者用细针头（24G）反复抽吸。这有助于破碎残余的完整细胞器和DNA，增加蛋白的溶解量。超声处理后，样品可以离心（20,000 rcf(g) 10分钟）沉淀细胞碎片，取上清使用。

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Q

CST抗体做WB，如何稀释？

CST抗体的稀释信息可在产品网页的实验步骤部分查看。    

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Q

封闭和二抗稀释的条件是什么？    

封闭和二抗稀释条件可在产品网页的实验步骤部分查看。

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Q

CST抗体是否可以做荧光Western?在操作时有何注意点？   

虽然CST没有在荧光Western Blot中验证抗体，但CST抗体应能很好地在这一应用中使用。我们建议使用🔗我们的推荐步骤进行荧光Western Blot。传统的Western Blot与荧光Western Blot的关键区别在于封闭缓冲液中不可含有Tween® 20。这是因为Tween® 20有自发荧光，并会增加非特异背景。封闭后的稀释液和洗涤缓冲液中可以含有Tween® 20。

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Q

为什么我做WB时，CST不建议用我自己的实验步骤进行实验？

在CST，我们在产品开发的过程中会尝试多种步骤来确定特定抗体的最佳使用条件。产品网页中的实验步骤是CST发现可以使结果最优的步骤。与推荐方法的差异可能导致背景增加或者信号弱，导致实验失败。推荐实验步骤的改变会对Western Blot产生何种影响的具体案例可点击此处 。WB问题排查指南可点击此处。

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Q

为什么我的条带分子量与说明书有偏差？

某些处理条件可能会改变蛋白的翻译后修饰，如磷酸化或泛素化，导致其分子量与CST网页或说明书中显示的分子量不同。此外，一些处理可能会导致蛋白剪切，导致不同大小分子量的出现。

还有许多实验条件可以导致蛋白质出现的位置与预期分子量不同。使用不同浓度或成分的凝胶可导致蛋白的位置与CST网页上所显示的出现不同。此外，合适的样品制备和储存对于避免蛋白降解至关重要，降解会导致蛋白剪切、拖带或多带，以及低信号或无信号的问题。

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Q

为什么我的WB没有信号？

选择合适的样本对获得目的信号至关重要。很多靶标需要有特定的处理来诱导，使得它在细胞模型中表达，然后再通过WB观察。还有一些靶标仅在非常特定的细胞类型或组织中表达。因此，必须谨慎选择样本类型。

此外，一些抗体对某些封闭或稀释缓冲液敏感。CST建议遵循我们针对特定产品的推荐实验步骤来进行操作，以获得最佳结果。当在样品中没有观察到信号时，使用合适的阳性和阴性对照对于确定问题原因十分重要。

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