我们推荐先用经过C&R验证的抗体，然后可考虑仅ChIP或ChIP-seq验证的抗体。然而，我们发现并非所有仅ChIP-seq验证的抗体都能用于C&R。此外，Peter J. Skene et al. (2017; PMID28079019) 建议尝试经过IF方法验证的抗体，因为CUT&RUN中，抗体的结合发生在核完整的环境下，这类似于荧光实验。
Digitonin渗透细胞膜并提取胆固醇。与质膜相比，缺乏甾醇的膜(如核膜)受Digitonin的影响很小。因此，用Digitonin处理细胞是一种在不损害细胞核完整性的情况下通透细胞的有效方法。它有助于防止实验过程中非特异性大染色质DNA从细胞核中释放出来，从而确保较低的背景信号。
Digitonin反复高温加热有没有影响？使用时需要溶解完全什么样子？可以分装吗
CST内部测试过延长Digitonin加热时间，对实验没有明显影响。因此相对于加热，更担心的是不完全溶解造成样本通透不足。每步使用前，都需要确认它已经彻底溶解。溶解完全时液体为无色透明状态，没有颗粒物。如果客户需要分装的话，需要注意分装会造成量的损失（枪头，管壁），避免不够24个反应的用量。
pAG-MNase的用量是否需要根据抗体的用量调整？
目前我们都是用ChIP的推荐稀释比例来做C&R实验的，我们的内部测试结果提示抗体稀释比不会显著影响实验结果。不管抗体量如何，无需调整酶的使用量。我们CUT&RUN优化后的消化条件在多种细胞系中都能工作，包括贴壁和悬浮细胞。此外，当增加或减少pAG-MNase的加入量和消化时间时，我们没有观察到染色质消化有显著变化。这一观察与Peter Skene et al. (2018; PMID29651053)一致。
对于组蛋白修饰一般150bp,转录因子80bp,所以设计qPCR引物的时候要注意PCR产物长度。
CUT&RUN 与 ChIP-seq 建库、测序以及分析方法是否完全一样，只是reads减少吗？
CUT&RUN 和ChIP（酶解、超声）得到的DNA的片段化长度和产量是不一样的，因此拿到DNA之后建库的时候也要做针对性的优化。具体参考官网说明书VII。两者测序后分析方法类似。Reads数取决于测序深度，而非方法本身。
CUT&RUN 可以用于动物组织吗？冻存的组织可以吗？
我们尚未在组织样本上测试过我们的CUT&RUN试剂盒，因此我们不知道其效果如何。在组织CUT&RUN中，必须将组织先分离为单细胞悬液，再进行CUT&RUN。在Derek H. Janssens et al. (2018; PMID30577869)中，作者将脑组织进行速冻，解冻，然后在CUT&RUN洗涤缓冲液中分离，再进行CUT&RUN实验。将脑组织分离为单细胞是较容易和快速的。对于其他纤维较多的组织，建议在分离和进行CUT&RUN之前先适当固定下，再进行分离和CUT&RUN，并在从细胞中分离出消化的DNA后，进行解交联。
这取决于Input gDNA有没有被片段化过。CST目前的ChIP和C&R纯化柱适合于10kb以下片段。如果Input样品经过超声或者酶解片段化处理，则可以使用CST柱子纯化。如果Input gDNA为完整的基因组，应该使用大片段的纯化方法（比如gDNA柱纯化和苯酚氯仿纯化）。
对于CUT&RUN实验中的阳参和阴性对照中input%，是否有像ChIP试剂盒那样推荐的范围？
目前CUT&RUN的经验还不如ChIP充足，但我们基本上参考ChIP的标准。在CUT&RUN中，IgG背景可能比ChIP里会高一点，不过和阳性对照比，信号倍数至少3倍以上。
CUT&RUN 测定法在用于分析转录因子和辅因子结合、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合时的注意事项，动植物细胞的实验处理区别和特别要注意的地方？
CUT&RUN用于不同靶蛋白，会有产物DNA片段大小和DNA得率的区别。目前从CST的经验来看转录因子类富集的片段大小峰值在80-100bp左右，产量1个反应0.5-10ng。组蛋白修饰富集片段大小峰值在100-150bp左右，产量1个反应1-20ng。根据片段大小和产量可以适当参考选择纯化方法、PCR分析的引物扩增子、DNA测序文库构建的温度设置，详见说明书。对哺乳动物细胞样本，参考说明书即可。如果是植物样本，可以参考文献：Zheng, X-Y, . et al. (2019) Plant Reprod, 32(1):63-75.
Total Histone H3 在CUT&RUN反应中表现不佳。这点得到CST内部验证和Henikoff实验室的双重确认,因此我们不建议选择Histone H3作对照。和ChIP不一样，在CUT&RUN中我们没有一个针对任何引物都适用的真正意义上的阳性对照抗体。因而，我们选择了一个最容易操作成功率最高的组蛋白修饰H3K4me3并且配备了相应的阳性对照引物。其在全基因组内的结合区域，有阴性和阳性的区域，更方面测序时在整个基因组内观察计算信噪比。如果选用其它组蛋白修饰抗体作为实验对照（如H3K27me3或者H3K36me等等），需要自行考虑以下两个因素：1，要自行设计针对此阳性对照抗体的阳性引物（每种不同修饰组蛋白其DNA结合位点不同）；2，要考虑这个抗体是否在CUT&RUN中得到验证并持续稳定产生强信号。
当使用100K细胞时，C&R和C&T用组蛋白抗体在全基因组中可产生相当的信号。然而，C&T在检测转录因子和辅因子时并不能很好工作。
CUT&RUN qPCR信号低，为了排除蛋白从染色质掉落，是否可以先用甲醛将细胞固定，再进行CUT&RUN的步骤？
我们目前的CUT&RUN步骤在活细胞的辅因子（松散或间接结合DNA）中效果良好。请在网页中查看辅因子的C&R数据实例，如RING1B和Bmi1。需要注意，对于转录因子/辅因子，4℃消化（冰箱中）通常比在0℃消化（冰上）产生更强的信号。
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整理 | CST 技术团队
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To Be Continued
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