Cell Signaling Technology（CST) 技术团队将分类整理了客户最常咨询的问题（Frequent Questions & Answers），问题涉及#如何选择抗体 #抗原序列 #购买CST抗体的方法 #抗体验证 #WB、IP、IF、ChIP、CUT&RUN等实验应用的优化。
往期回顾：🔗第一期：抗体100问（一）
🔗第二期：抗体100问（二）
🔗第三期：免疫沉淀篇
第四期：Immunefluorescent（IF)
验证抗体时和产品网页的结果图使用的IF实验步骤见产品网页-实验步骤部分。通过下拉菜单，选择IF。产品网页上的实验步骤是针对该抗体的，因此在使用多个抗体时，需确认每种产品的实验方案。
CST抗体做细胞免疫荧光（IF-IC），如何稀释？
CST抗体的稀释信息可见产品网页中产品信息部分。详尽的稀释方法见产品网页的实验步骤部分。
在CST，我们在验证抗体时一般不使用FFPE样本结合荧光检测的方法。这是因为FFPE样本在处理过程中会导致高自发荧光，且蛋白损失也较大。这些原因会造成信号损失和表位遮蔽，所以，需要使用信号放大系统和复杂的光谱成像设备，而客户可能较难获得此类设备。关于哪些抗体可以用于FFPE样本，推荐化学显色法IHC的抗体可适用于FFPE样本。我们的IHC-P抗体验证方法是利用催化反应生成不溶产物的方法，因此我们建议用户使用类似的策略。为了模拟化学显色法IHC的条件，需要使用另一种信号放大方法（如酪胺放大）。CST设计了一套多色IHC实验步骤--
使用酪胺信号扩增实验步骤的荧光多重免疫组织化学 (mIHC) 实验
（详细步骤请见：https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-fluorescent-multplex-ihc），可能对您有所助益。还有一种可能，如果靶标丰度高，比如H2A.X，样本中保留了足够多的信号，那您可以使用间接免疫荧光法检测样本。以上方法均取决于样本、靶标，并且具体条件需要进行优化。如您想尝试该方法，建议您遵循IHC实验步骤的A-C部分，然后进行IF步骤的C部分，实验步骤可见产品网页。
为什么我发现你们结果图中荧光素的颜色和一般认为的不符？
大多数成像系统以灰度形式捕获荧光发射光，并使用查询表（look-up tabel, LUT)来赋予符合染料发射光峰值的色彩。例如，DAPI传统上是蓝色的，因为它是一种可被紫外激发的蓝色染料。基于DAPI光谱，它的可见光范围可以从紫色一直到绿色。有时我们觉得，为了让靶蛋白有更好的可视性，我们就没有使用LUT色彩。例如，Alexa 555发黄光，但我们经常选择将其显示为红色，因为这会使它在DAPI(蓝色)和Alexa 488(绿色)中有明显的对比。当我们以非标准的方式展示结果时(例如，DAPI为红色)，我们在图注中会注明“伪彩”。
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To Be Continued
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